復合酶法制備小麥面筋蛋白咸味酶解液的工藝優化

董彩虹，溫青玉，李天齊，張康逸，張 雨，劉清浩,

（1.中北大學化學工程與技術學院，山西太原 038507；2.河南省農業科學院農副產品加工研究中心，河南省全谷物小麥制品加工國際聯合實驗室，河南省全谷物鮮食加工工程技術研究中心，河南鄭州 450002；3.河南省安康食品科技研究院，河南鄭州 450006）

咸味俗稱“百味之王”，作為一種重要的基本味，是調制各種復合風味的基礎，在食品調味中不可或缺[1]。世界衛生組織建議成人的鹽攝入量一天應該不超過6 g，而調查顯示我國居民實際鹽攝入量在12 g左右[2]。流行病學、干預和遷移研究以及動物實驗表明，食鹽攝入與高血壓、心血管疾病和飲食類疾病之間存在直接相關性[3-5]。此外，干預研究還表明，減少飲食中鈉的攝入量可以降低高血壓的發病率[6-7]和抑郁癥的患病風險[8]。因此，要實現全民健康，減鹽是極其重要的一個方面。目前，針對于減鹽的措施主要有：減少食鹽添加量、改善食品加工工藝、優化食鹽物理形態、開發食鹽替代物低鈉鹽等。市場上食鹽代替物有咸味肽、咸味增強肽、風味改良劑等[9]，其中咸味肽是一種較為理想的食鹽替代物[10]，尤其對于需低鈉食品的特殊群體來說，咸味肽產品是未來研發的重點。而咸味酶解液作為制備咸味肽和咸味香精的基礎，其研究對于咸味肽的開發和應用具有重要意義。

目前已有多項關于咸味酶解液研究的實驗，原料多數為動物源蛋白質，如王欣等[11]利用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶協同酶解哈氏仿對蝦蛋白，獲得咸味酶解液；李迎楠等[12]通過酶解牛骨獲得咸味酶解液，經進一步分離獲得一種單一的咸味肽；SCHINDLER等[13]通過2種蛋白酶水解魚肉蛋白制得咸味酶解液，經進一步分離純化得到具有一定咸味的L-精氨酸和精氨酰二肽（RA、AR、RP、RS、RG、RV、VR、RM）。然而動物蛋白不易儲存、成本較高、存在藥物殘留、重金屬污染等安全隱患。相比來說，植物蛋白來源更加廣泛，成本低且相對安全，如彭增起等[14]通過2種蛋白酶酶解大豆蛋白，經進一步分離純化，得到一種純凈的咸味肽，其氨基酸序列為Gly-Lys；楊文君等[15]通過風味蛋白酶酶解豌豆蛋白，獲得咸味酶解液，為研究豌豆蛋白咸味肽奠定基礎。

小麥面筋蛋白又稱谷朊粉、活性面筋蛋白，是小麥淀粉加工過程中的副產物，其蛋白質含量高達75%～85%，而且含有人體必須的十五種氨基酸，是一種價格低廉、營養豐富的植物蛋白資源。迄今為止，小麥面筋蛋白酶解制備肽的研究主要集中于抗氧化肽[16]、抗菌肽[17]、ACE抑制肽[18]、富含谷甘氨酸肽[19]等方面，也有關于利用酶解小麥面筋蛋白制備呈味肽的研究，如鮮味肽[20]、低苦味肽[21]，還未發現在咸味方面的研究。

本實驗以酶解溫度、酶解pH、底物濃度以及酶添加量為考察因素，研究不同酶解工藝參數對面筋蛋白水解度以及酶解液咸味感官評分的影響，并通過響應面法進一步優化小麥面筋蛋白咸味酶解液制備工藝，以期實現對小麥面筋蛋白的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小麥面筋蛋白 封丘縣華豐粉業有限公司；復合酶（風味蛋白酶（28000 U/g）：堿性蛋白酶（46000 U/mL）：復合蛋白酶（44000 U/g）=0.45：0.36：0.19），三種酶的酶活均為實際測定 諾維信（中國）生物技術有限公司；食用氫氧化鈉 天津市津華化工廠；食用鹽酸 開封市旭信化工有限公司；食用NaCl河北綠海康信多品種食鹽有限公司；甲醛、甲醇、乙腈 均為分析純。

YP-N型電子分析天平 上海精密儀器儀表有限公司；DSHZ-300 型多用途恒溫水浴振蕩器 江蘇太倉市實驗設備廠；JW1042低速離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司；FD-100S 真空冷凍干燥機 北京惠城佳儀科技有限公司；SA402B電子舌 日本INSENT 公司；Agilent 1260（四元泵）高效液相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小麥面筋蛋白酶解工藝流程 稱取一定量小麥面筋蛋白粉與蒸餾水混合成懸濁液，用0.1 mol/L的NaOH溶液或HCl溶液調節溶液pH，放置水浴鍋中預熱后添加復合酶進行酶解，6 h后煮沸滅酶15 min，冷卻至室溫，3000 r/min離心15 min，上清液即為小麥面筋蛋白咸味酶解液，-35 ℃下冷凍干燥70 h，4 ℃貯藏待用。

1.2.2 單因素實驗 設定單因素水解的基本條件為：復合酶加酶量為3000 U/g，底物濃度為5%，pH為7.0，反應溫度為50 ℃，反應時間6 h。以小麥面筋蛋白的水解度和咸味感官評分為指標，改變其中一個條件，固定其他條件并分別考察復合酶添加量、酶解pH、底物濃度以及酶解溫度對小麥面筋蛋白水解效果的影響。各因素梯度設定：復合酶添加量分別為1000、2000、3000、4000、5000 U/g蛋白；酶解pH 分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0；底物濃度分別為5%、6%、7%、8%、9%；酶解溫度分別為40、45、50、55、60 ℃。

1.2.3 響應面設計實驗 參考單因素實驗結果，以水解度指標，通過響應面設計進一步優化4個因素對提取小麥面筋蛋白咸味酶解液的影響。4個因素為變量，分別以A、B、C、D表示，以水解度Y為響值，以-1、0、1分別代表變量的水平。實驗設計的因素水平如表1。

表1 響應面因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.4 水解度的測定 采用甲醛滴定法測定蛋白質水解度[22]。步驟如下：取離心后上清液5 mL，加入 60 mL蒸餾水，進行磁力攪拌（60 r/min），首先用0.1 mol/L標準NaOH溶液滴定至溶液pH至8.2，再加入20 mL pH為8.2的甲醛溶液，攪拌1 min后用0.1 mol/L標準NaOH溶液滴定溶液pH至9.2，并記錄第2次滴定所消耗的NaOH的體積V1；以蒸餾水為替代樣品，同時做空白實驗，滴定所消耗的NaOH的體積V2。公式如下：

式中，C表示NaOH標準溶液濃度（mol/L）；V表示水解液總體積（mL）；M表示酶解小麥面筋蛋白的質量（g）。

1.2.5 咸味感官評價 參考陳瑞霞等[23]對淘汰雞蛋酶解液的咸味評定方法，對面筋蛋白咸味酶解液進行感官評定。感官評價小組由經過專業培訓的8名男性和8名女性組成，年齡在20～35歲之間。咸味評分采用10分制（0表示沒有咸味，3表示咸味較淡，5表示咸味適中，7表示咸味較強，10表示咸味強烈）。評定過程在溫度為（25±2） ℃的感官評價室進行，感官評價人員每次取1 mL樣品進行評價，10 s后吐出，蒸餾水漱口，每個樣品間隔1 min。以感官評分的平均值作為最終咸味得分。

1.2.6 電子舌咸度測定 通過電子舌檢測2%濃度的樣品溶液咸度，以0.2%～1.0%的食鹽溶液為對照。采用日本 INSENT公司的SA402B電子舌系統，該系統包括CAO、COO、AE1、AAE、CTO 5個傳感器陣列、一個參比電極（ Ag /AgCl）、電信號處理器以及模式識別系統組成。其中，CTO反映樣品的咸味強度。在正式測定前傳感器和參比電極需要進行前處理、校準、初始化過程，以此確保數據的穩定性和可靠性。每個樣品均采集 4 次，采用最后三次的數據。

1.2.7 酶解液分子量分布的測定 參考任嬌艷等[24]的方法并略作修改。以溶菌酶（相對分子量14400 Da），胰島素（相對分子量5800 Da），維生素B12（相對分子量1300 Da），還原型谷胱甘肽（相對分子量300 Da）為標準品，高效液相色譜法檢測不同分子的保留時間，作分子量與保留時間的標準曲線。通過比較樣品不同組分的保留時間計算樣品的分子量分布。高效液相色譜條件：樣品過 0.22 μm微孔濾膜，色譜柱TSK-GELG 2000 SWxl 7.8 mm×300 mm，進樣量20 μL，溫度35 ℃，檢測波長220 nm，流速0.5 mL/min，流動相為乙腈:水:TFA=20:80:0.1。

1.3 統計分析

每個實驗均為3次，結果以X±RD 表示，通過SPSS13軟件進行分析；采用Origin 2017軟件作圖；響應面試驗結果用Design-Expert 8.0.6 軟件進行參數優化及方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

研究報道表明，在小麥面筋蛋白酶解過程中，小麥面筋蛋白水解度受酶解溫度、酶解pH、底物濃度以及酶添加量的影響[25]。

由圖1A可知，隨著復合酶添加量的增大，水解度和咸味感官評分增大，加酶量超過4000 U/g后，水解度和咸味感官評分減小。酶添加量為4000 U/g時，水解度和咸味感官評分均達到最大，分別為（32.85%±0.5%）和（6.16±0.11）。酶添加量達到4000 U/g后，水解度降低，可能是由于酶濃度超過底物濃度，導致蛋白酶之間相互水解及酶活降低。馬詩文等[26]的研究同樣表明在酶解過程中，相同時間內酶用量會影響蛋白酶與底物的結合，也可能導致酶作為一種蛋白，相互發生酶解反應，使水解效果增幅變緩。綜合兩者結果，酶添加量選用4000 U/g。

由圖1B可知，隨著酶解溫度的增大，水解度與咸味感官評分顯著增大（P＜0.05），當酶解溫度為55 ℃時，水解度與咸味評分達到最大分別為（31.37%±0.47%）與（6.07±0.12），超過55 ℃時，水解度與咸味感官評分減小。由于蛋白酶有其適宜的溫度，溫度過低時，會抑制蛋白酶的活性；溫度過高，可能會引起蛋白酶次級鍵解離，蛋白酶的結構被破壞，喪失部分或全部催化活性[27]。綜合兩者結果，酶解溫度選用55 ℃。

由圖1C可知，隨著酶解pH的增加，水解度與咸味感官評分不斷增加，pH超過7.5時，水解度與咸味感官評分減少。酶解pH為7.5時，水解度和咸味評分達均到最大，分別為（31.07%±0.35%）和（6.14±0.09）。可能是由于不同蛋白酶有其適宜的pH，pH過高或過低都會影響蛋白酶結構的穩定性，從而影響蛋白酶與底物的水解過程。寧芯等[28]研究發現溶液的pH會引起H+濃度的變化，可以影響蛋白酶自身的解離和底物的解離，從而影響酶與底物蛋白的結合與催化。綜合兩者結果，酶解pH選用7.5。

圖1 4種因素對小麥面筋蛋白水解度和咸味感官評分的影響Fig.1 The effects of 4 factors on hydrolysis degree and salty taste sensory score of wheat gluten

由圖1D可知，小麥面筋蛋白的水解度以及咸味感官評分隨著底物濃度的增大而減小，底物濃度為5%時，水解度與酶解液的咸味評分達到最大分別為（30.27%±0.40%）與（6.13±0.11），可能是由于在相同酶添加量的條件下，較高的底物濃度會導致酶解體系的流動性差，蛋白酶與底物不能充分接觸，抑制酶解反應速率。劉英麗等[22]研究同樣表明底物濃度增大影響了蛋白酶與底物蛋白的混合，使得酶與底物不能充分接觸，導致水解降低。底物濃度太低，得到的咸味酶解液較少，增加后期樣品制備難度。綜合考慮，底物濃度選用5%。

2.2 響應面設計實驗結果

2.2.1 回歸模型的建立與顯著性分析 響應面法是實驗優化方法中最常用的一種，該法已廣泛應用于制備生物肽的實踐中[29-31]。由單因素實驗結果可以看出，小麥面筋蛋白的水解度與咸味感官評分成正比，因此響應面實驗設計以水解度為響應值。運用Design-Expert 8.0.6中Box-Behnken設計進行實驗優化，4個因素分別設置3個水平，共29組實驗組合。實驗設計方案及結果如表2所示。

表2 響應面實驗設計方案及結果Table 2 The schemes and results of response surface design

通過Design-Expert 8.0.6響應面分析軟件對29組水解度實驗結果進行回歸擬合，得到Y（水解度）的回歸方程為：

通過軟件對回歸方程進一步進行方差分析，結果見表3。

由表3可知，一次項中A、D以及二次項中BC對小麥面筋蛋白咸味酶解液的水解度的影響極顯著（P＜0.01）；二次項中AB、AC對小麥面筋蛋白咸味酶解液的水解度的影響顯著（P＜0.05）。由此可知，各因素之間的交互作用比較顯著，各具體試驗因素對麥面筋蛋白咸味酶解液的水解度的影響不僅僅是簡單的線性關系。由表3可知，Pr＞F＜0.0001表明回歸方程的模型顯著；模型失擬項為0.1564＞0.05無顯著性影響，表明模型的擬合程度較好，對水解度的分析可采用此回歸方程解釋。方程的決定系數R2為0.9517表明方程的相關性較好，可以通過該模型對水解度很好的做出預測；RAdj-Squared為0.9035，說明此模型可以解釋90.35%的小麥面筋蛋白水解度數據的響應 值 變 化；RPre-Squared（0.7464）與RAdj-Squared（0.8643）差值小于0.2，表明回歸模型可以充分說明小麥面筋蛋白酶解過程。實驗的精確度可以用離散系數表示[32]，此次實驗的精確度為1.76%，說明模型方程能夠較好地反映真實值。

表3 響應面方差分析Table 3 Response surface analysis of variance

2.2.2 三維響應面分析 三維響應面圖和等高線圖可以對回歸方程進行更清楚的描述，能夠直接表現出每個因素與響應值之間的關系以及因素間的交互作用，進一步生成最優工藝條件[33]。圖2～圖7顯示，隨著各因素水平的升高，水解度均呈現先增大后減小的趨勢,說明4個因素在所選范圍內均存在極值。等高線是響應面水平方向的投影，等高線為橢圓時，交互作用顯著；等高線為圓形時，交互作用不顯著[34]。圖2～圖7中，BC、CD的等高線圖為橢圓，表明交互作用顯著，其次是AB與AC，而AD與BD等高線圖為圓形，表明交互作用弱，這與F值結果一致。圖2表明在酶添加量為4000 U/g，底物濃度為5%，酶解時間6 h的條件下，酶解溫度與酶解pH相互作用對小麥面筋蛋白水解度的影響。酶解溫度在50～56 ℃，pH在7.0～7.5的范圍內，水解度隨著溫度和pH的增大而增大，溫度超過56 ℃和pH超過7.5時，水解度呈下降趨勢。圖3、5同理，底物濃度在4.5%～4.9%的范圍內，小麥面筋蛋白水解度逐漸增大；在4.9%～5.5%的范圍內，小麥面筋蛋白水解度逐漸減小。由圖4、6、7可以看出，酶添加量在3000～4000 U/g的范圍內，水解度隨著酶添加量的增大而增大，而超過4000 U/g時，水解度趨于平緩。從圖2～圖7整體來看，每兩個因素之間均存在協同作用，與單因素實驗中所表現出來的趨勢一致。

圖2 溫度與酶解pH交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.2 Response surface map and contour map of the interaction between temperature and enzymatic pH

圖3 溫度與底物濃度交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.3 Response surface map and contour map of the interaction between temperature and substrate concentration

圖4 酶添加量與溫度交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface map and contour map of the interaction between enzyme addition and temperature

圖5 酶解pH與底物濃度交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface map and contour map of the interaction between pH and substrate concentration

圖6 酶解pH與酶添加量交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface map and contour map of the interaction between pH and substrate concentration

圖7 底物濃度與酶添加量交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface map and contour map of the interaction between substrate concentration and enzyme addition

2.2.3 最優條件組合驗證 通過Design-Expert 8.0.6響應面分析軟件進行優化，可以得出小麥面筋蛋白咸味酶解液的最優工藝條件為：酶解溫度55.7 ℃，pH7.4，復合酶添加量3799 U/g，底物濃度4.9%。在此條件下水解度的理論值為33.47%。通過3次驗證試驗發現，在此條件下所得水解度依次為32.61%，33.49%和33.26%，均與模型預測值33.47%相差較小，表明此模型可以很好的預測小麥面筋蛋白水解工藝。

在最優工藝下得到的咸味感官評分為（6.47±0.22）。表明在此工藝下，既可以減少原料的浪費，又可以得到更高的小麥面筋蛋白咸味酶解液。可以選用此工藝進行下一步分離純化。

2.3 電子舌分析

電子舌是模擬人體味覺機理研制出的一種基于化學傳感器和模式識別的智能電子系統，能夠模擬人的舌頭對樣品的酸、甜、苦、咸、鮮和澀味進行評價，是近年來快速發展的一種分析檢測液體滋味的新型手段[35]。表4為不同濃度的食鹽溶液測定結果。

表4 食鹽溶液咸度測定Table 4 Determination of salinity of table salt solution

2%的小麥面筋蛋白咸味酶解液通過電子舌測定，咸度值為（7.63±0.02）。與表4中不同濃度的食鹽溶液咸度值比較，可以看出，2%濃度的酶解液與0.7%的食鹽溶液咸度相當。因此，在同等咸度下，此酶解液可代替約35%的食鹽，具有一定的實際應用價值。

2.4 酶解液的分子量分布

由圖8可知，對四種標準品的相對分子量的對數以及保留時間做曲線，得出的標準曲線為Y=-0.17087X+6.22，R2=0.9696，說明線性良好。將最優酶解工藝條下得到的小麥蛋白酶解產物進行分子量分布分析（圖9），根據標準曲線計算各分子段（MW＜1000 Da，1000～3000 Da，3000～5000 Da及＞5000 Da）百分比（表5）。

圖8 標準品的相對分子質量分布圖Fig.8 Molecular weight distribution profiles products of standard samples

圖9 酶解產物色譜圖Fig.9 Chromatogram of enzymolysis products

由表5可知，在最優工藝條件下，小麥面筋蛋白酶解產物的分子量主要集中在5000 Da以下，其中小于3000 Da的肽占主要部分，約為92.07%，其中分子量小于1000 Da的肽占78.33%。LIOE等[36]研究表明風味肽主要是分子量小于3000 Da的肽。李迎楠等[12]研究表明，咸味肽的的組分是分子量小于1000 Da的短肽。因此，此酶解條件下制備的小麥面筋蛋白咸味酶解液可以為后續深入研究小麥咸味肽奠定基礎。

表5 小麥面筋蛋白酶解產物的肽分子量分布Table 5 The molecular weight distribution of peptides from WG hydrolysates derived from enzymatic hydrolysis

3 結論

本實驗通過單因素實驗研究組合酶酶解小麥面筋蛋白水解度以及咸味感官評分，再通過響應面設計優化出酶解小麥面筋蛋白最佳工藝為：底物濃度4.9%，酶解溫度55.7 ℃，pH7.4，復合酶添加量3799 U/g（蛋白）。經實際驗證，在此條件下，小麥面筋蛋白咸味酶解液水解度和感官評分達到最佳，分別為（33.12%±0.45%）和（6.47±0.22），進一步通過電子舌數據分析，在同等咸度下，此酶解液可代替約35%的食鹽。通過分子量分布分析，酶解液以相對分子量小于1000 Da的小分子肽為主，推測其咸度可能與其小分子多肽含量有關。此研究為咸味肽的開發利用提供了新的渠道，對于替代高鈉調味品有廣闊的應用前景。