超聲輔助提取薰衣草總三萜的工藝優化及體外抗氧化活性研究

尼格爾熱依·亞迪卡爾，鄧淑萍，白 玉，古麗皮耶·吾普爾

（新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052）

薰衣草是一種生長在高溫低濕地區的香草植 物，我國主要產區在新疆伊犁并作為當地的支柱經濟產業之一，具有一定的市場規模[1]。薰衣草具有很高的利用價值，多加工生產成精油。精油是由不同類型的芳香族化合物組成的混合物[2]，因薰衣草精油具有鎮靜催眠[3]、抗菌[3]、抗氧化[4]等藥理活性，加之提取技術相對成熟，價格適宜，因此被開發成諸多深受人們喜愛的薰衣草精油產品。薰衣草殘渣多作為廢料處理[5]，其非揮發性化學成分的價值不能得到充分發揮。薰衣草主要研究方向為栽培培育[6]、精油成分[7]和生物活性評價[8]，而其殘渣的化學成分鑒定及生物活性研究相對較少，目前國內外對薰衣草非揮發性部位分離得到了三萜類[9]、黃酮類[10]、苯丙素類[11]、酚類[12]、肉桂酸類[13]、咖啡酸類[14]等化合物，其中三萜類是一種在植物中廣泛分布的化合物類別，具有較好的抗氧化活性[15]。

植物中非揮發性物質的傳統提取方法有浸提法、回流提取法[16]、索氏提取法[17]、超聲波提取法[18]、微波提取法[19]、超臨界萃取法[20]、常溫超高壓提取法[21]、亞臨界水萃取法[22]、雙水相萃取法[23]、沉淀吸附法[24]等。在實驗室中常用的提取方法有回流法、超聲輔助法、索氏提取法和微波輔助提取等提取方法。在這些方法中，回流提取法、浸提法和索氏提取法相對耗時較長、效率低，微波提取法相對溫度變化較快，會對產物生物活性產生一定影響，而其他方法如超臨界流體萃取和超高壓提取法等方法對設備要求較高、成本相對較高，而超聲輔助提取法具有用時短、提取效率高等優點。

因此本文采用超聲輔助提取法，研究乙醇濃度、料液比、超聲功率和提取時間4個因素對總三萜提取的影響。以薰衣草精油提取后的殘渣中總三萜的提取量作為指標，采用響應面法優化超聲輔助提取工藝，以期得到最優提取總三萜的工藝條件，并對總三萜提取物進行DPPH自由基、OH自由基、O2-自由基清除率測定，為薰衣草植物資源合理開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

法國蘭薰衣草 新疆伊犁河谷生物科技有限公司；熊果酸 標準品（純度 98%），成都普菲德生物技術有限公司；超純水 實驗室自制；無水乙醇、95%乙醇、冰乙酸、氫氧化鈉 天津致遠化學試劑有限公司；高氯酸 天津市鑫鉑特化工有限公司；硫酸亞鐵天津永晟精細化工有限公司；鄰二氮菲 天津市福晨化學試劑廠；鄰苯三酚、香草醛、DPPH、H2O2、Tris-HCI、Sigma 天津市北聯精細化學品開發有限公司；以上分析用試劑均為分析純。

UV-1200型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；FW135型高速多功能粉碎機 北京市永光明醫療儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器、HH-S數顯恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠；KQ2200B超聲清洗機（總功率650 W） 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 薰衣草殘渣總三萜測定方法

1.2.1.1 配制標準溶液 精密稱取20.00 mg熊果酸標準品，在避光條件下以無水乙醇定容至50 mL容量瓶中，得到質量濃度為400 μg/mL的熊果酸標準溶液。準確吸取2.5 mL熊果酸標準溶液，置于10 mL容量瓶中，無水乙醇定容，即得100 μg/mL質量濃度熊果酸標準溶液[6]。

1.2.1.2 繪制標準曲線 準確吸取100 μg/mL質量濃度熊果酸標準溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL分別置于提前標記過的試管（0、1、2、3、4、5）中，85 ℃水浴鍋揮干溶劑，加入0.3 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液，搖勻；加入1.0 mL高氯酸，搖勻；60 ℃水浴溫育15 min，后置于冰水冷卻至室溫；加入5.0 mL冰乙酸搖勻，放置15 min顯色；以空白試劑（0號試管）為參比，通過測定546 nm波長處吸光度通過繪制標準曲線[7]。以熊果酸標準品含量（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制熊果酸標準曲線[6]并得到回歸方程為：y=0.057x+0.003，決定系數R2為0.9994。

1.2.1.3 薰衣草殘渣總三萜的提取及含量測定 薰衣草提取三次精油后的殘渣稱取500 g于粉碎機粉碎后，過40目篩得到粗粉備用。精密稱取粗粉1.0 g，置于100 mL錐形瓶中，加一定體積一定濃度的乙醇，在一定功率和時間下超聲輔助提取，重復三次，濾液合并后濃縮，用無水乙醇定容至50 mL，搖勻，精密吸取2.5 mL提取液置于10 mL容量瓶中定容至刻度線，進行測定，并按照下述公式計算總三萜提取量[6]。

式中：C為線性方程計算出樣品的質量濃度，μg/mL；D為測定時定容的體積，mL；V為提取液定容體積，mL；B為吸取測定體積，mL；M為稱取的樣品質量，g；m為樣品中總三萜質量，mg。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 乙醇濃度對總三萜提取量的影響 乙醇濃度分別為50%、60%、75%、90%、100%時，在料液比1:20（g/mL）、超聲功率260 W、超聲時間45 min的條件下，測得其總三萜提取量。

1.2.2.2 料液比對總三萜提取量的影響 料液比分別為1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL時，在無水乙醇、超聲功率260 W、超聲時間45 min的條件下，測得其總三萜提取量。

1.2.2.3 超聲功率對總三萜提取量的影響 超聲功率分別為40%、50%、60%、70%、80%（總功率為650 W）時，在無水乙醇、料液比1:20（g/mL）、超聲時間45 min的條件下，測得其總三萜提取量。

1.2.2.4 超聲時間對總三萜提取量的影響 超聲時間分別為30、45、60、75、90 min時，在無水乙醇、料液比1:20（g/mL）和超聲功率260 W的條件下，測得其總三萜提取量。

1.2.3 響應面優化試驗設計 采用統計分析軟件Design-Expert 8.0.6，以乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲功率（C）和超聲時間（D）作為因素，以總三萜提取量（Y）為考察值，進行4因素3水平的Box-Behnken試驗設計，響應面試驗因素水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels design of response surface test

1.2.4 體外抗氧化活性測定

1.2.4.1 DPPH自由基清除率的測定方法 分別取質量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL 2 mL待測溶液，加入2 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH95%乙醇溶液，室溫下30 min避光靜置，于517 nm波長處測定得到吸光度值A1；對照組以95%乙醇溶液代替DPPH 95%乙醇溶液，測定得到吸光度值A2；空白組以95%乙醇溶液代替樣品溶液，測定得到吸光度值A0。以VC為參照，考察DPPH自由基清除率的強弱[15]。

1.2.4.2 OH自由基清除率的測定方法 在10 mL比色管中，依次加入0.3 mL濃度為7.5mmol/L硫酸亞鐵溶液、0.3 mL濃度為7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液、1 mL pH為7.45的Tris-HCI緩沖溶液，再加入1 mL濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的提取液和0.2 mL濃度為7.5 mmol/L H2O2溶液，用蒸餾水定容至刻度，在37 ℃水浴中，反應1 h，在536 nm下測定得到吸光度值A1；以蒸餾水代替H2O2測定得到吸光度值A2；以蒸餾水代替待測溶液測定得到吸光度值A0。以VC作為參照，考察OH自由基清除率的強弱[15]。

1.2.4.3 O2-自由基清除率的測定方法 在10 mL比色管中，依次加入2 mL濃度為0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液、2 mL濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的提取液、1 mL濃度為0.05 mol/L鄰苯三酚，超純水定容至刻度、搖勻，25 ℃條件水浴中加熱20 min后，加入0.5 mL鹽酸溶液終止反應，于波長330 nm處測定吸光度值，得到吸光度值A1；以蒸餾水代替待測溶液測定得到吸光度值A0。以VC作為參照，考察O2-自由基清除率的強弱[15]。

1.3 數據分析

應用 Design-Expert8.0.6軟件進行響應曲面試驗設計、數據分析和二次模型的建立，通過對回歸方程的解析以及響應曲面的分析獲得最佳變量水平，通過P值考察（P＜0.05）模型及因素的顯著性。所有試驗重復3次，數據結果用均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 薰衣草殘渣總三萜含量測定 采用超聲輔助提取法對1 g薰衣草殘渣進行提取，料液比為1:20，乙醇濃度為無水乙醇，超聲功率為260 W，超聲時間為30 min，超聲三次后合并濃縮定容，在546 nm的波長通過測定其吸光度，帶入公式計算得到總三萜的提取量為（11.19±0.15）mg/g。

2.1.2 各因素對薰衣草總三萜提取量的影響 乙醇濃度、料液比、超聲功率和超聲時間對薰衣草總三萜提取量的影響見圖1～圖4。如圖1所示，乙醇作為提取溶劑，乙醇濃度為自變量，較低濃度的75%乙醇相比無水乙醇提取量更高，推測與總三萜的化學極性大小有關，當提取溶劑極性較小時，提取出更多的雜質，因而總三萜的占比減少[18]。如圖2所示，使用不同比例的料液比進行提取，得到1:30的比例時提取量較高，高于此比例時，提取量降低。推測溶劑用量增大，超聲波與薰衣草粗粉的作用力減小[19]。如圖3所示，超聲時間到75 min時，其提取量達到較大值，隨著時間的延長提取量接近平穩趨勢，推測超聲時間越長，可能會影響部分三萜類化合物的穩定性，同時雜質溶出也會增加，反而降低了提取效果[21]。如圖4所示，當提取功率提高時，提取量逐漸增大，達60%時提取量最高，繼續提高功率提取量下降，推測隨著物料破碎程度增大，提取程度越完全而溶出了更多雜質，因此總三萜在提物取中占比減少，致使測定的總三萜含量減少[20]。通過單因素實驗選出各因素的較優水平，即乙醇濃度75%、料液比1:30、超聲時間75 min和超聲功率60%。

圖1 乙醇濃度對總三萜的提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on total triterpenes content

圖2 料液比對總三萜的提取量的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on total triterpenes content

圖3 超聲時間對總三萜的提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on total triterpenes content

圖4 超聲功率對總三萜的提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on total triterpenes content

2.2 響應面法優化薰衣草殘渣總三萜的提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計與結果 根據單因素實驗，得到各因素的較優條件，并將乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲時間（C）和超聲功率（D）四個因素帶入統計分析軟件Design Expert 8.0.6，以總三萜提取量（Y）為考察值，進行Box-Behnken設計，響應面試驗因素水平設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及其響應值Table 2 Response surface test design and response values

根據試驗結果，基于參數評估，采用Design Expert 8.0.6對表中的數據進行分析可以反映出響應值與被檢變量之間的邏輯關系，對其進行二次多元回歸方程擬合，即Y=40.40+1.47A+2.50B+0.79C+1.64D+3.04AB+5.81AC-0.49AD-4.14BC-1.06BD-1.49CD-4.62A2-3.74B2-3.10C2-1.87D2。為檢驗建立模型的有效性，利用Design Expert 8.0.6進一步進行分析，其中多元回歸模型的方差分析結果見表3。

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗 如表3所示，該模型的R2為0.9375，說明總三萜提取量的變化93.75%來自所選試驗因素，因此該模型能夠很好地描述各個因素與總三萜提取量之間的關系，校正決定系數R2Adj為0.8750表明該模型能夠解釋87.50%響應值的變化。該模型P值＜0.01，擬合極顯著，失擬相P＞0.05不顯著，其中A、D2因素顯著（P＜0.05），B、D、AB、AC、BC、A2、B2、C2極顯著（P＜0.01）。試驗因素的F值越大其影響響應值的程度越大，結果表明各因素對總三萜提取量影響大小為B＞D＞A＞C，即料液比＞超聲功率＞乙醇濃度＞超聲時間。

2.2.3 響應面交互作用分析 如圖5所示，響應面圖均為凹面曲面，表明乙醇濃度（A）、料液比（B）、超聲時間（C）和超聲功率（D）四個因素在一定范圍內與總三萜提取量呈拋物線關系，在試驗設定條件范圍內存在極高值。表3方差分析顯示AB、AC和BC均P＜0.01，與圖5中AB、AC和BC呈橢圓形的等高線圖相對應，表明乙醇濃度與料液比、乙醇濃度與超聲時間、料液比與超聲時間兩兩因素之間存在極顯著的交互作用。

圖5 各因素交互作用對薰衣草總三萜提取量影響的響應面圖Fig.5 Response surface diagram of the interaction of various factors on total triterpenes extraction from Lavandula angustifoli

表3 方差分析及顯著性檢驗Table 3 Variance analysis and significance test

2.2.4 驗證實驗 通過Design Expert8.0.6軟件求解方程得到最優工藝為乙醇濃度為89%，料液比為1:33，超聲時間為60 min，超聲功率為70% (445 W)，理論提取量為39.64 mg/g，在該條件下平行驗證三次計算得到實際提取量為（39.95±0.32）mg/g，與預測值接近，表明該工藝條件具有一定的可行性，此外與乙醇濃度為100%，料液比為1:20，超聲時間為30 min，超聲功率為260 W相比，提取量明顯提高，表明該工藝條件能有效提高薰衣草總三萜的提取量。

2.3 體外抗氧化活性測定

2.3.1 DPPH自由基清除率測定 圖6中隨著薰衣草總三萜濃度變大，DPPH自由基清除率呈現先上升后趨于穩定的趨勢，在總三萜濃度在0～0.8 mg/mL范圍內DPPH自由基清除率測定結果成劑量效應關系，當濃度達到0.8 mg/mL時，總三萜DPPH自由基清除率到達拐點，后繼續增加提取物濃度其清除率達到86.83%并趨于穩定。VC對照組濃度達到0.4 mg/mL時，DPPH自由基清除率出現拐點，其清除率達到90.21%，后繼續增加VC濃度，其清除率不再增加。薰衣草總三萜DPPH自由基清除率接近陽性對照VC，最高清除率是同等濃度VCDPPH自由基清除率的96.25%。

圖6 薰衣草總三萜的DPPH·清除率Fig.6 DPPH· clearance rate of total triterpenes from Lavandula angustifoli

2.3.2 OH自由基清除率的測定 如圖7所示，隨著薰衣草總三萜濃度的增大，OH自由基清除率呈現先上升后趨于穩定的趨勢，在總三萜濃度在0.1～0.7 mg/mL范圍內OH自由基清除率測定結果成劑量效應關系，當總三萜濃度達到0.5 mg/mL時，其OH自由基清除率達到42.06%，后趨于平穩，對照組VC的OH自由基清除率最高為85.31%，薰衣草總三萜OH自由基清除率小于陽性對照VC。

圖7 薰衣草總三萜的·OH清除率Fig.7 ·OH clearance rate of total triterpenes from Lavandula angustifoli

2.3.3 O2-自由基清除率的測定 如圖8所示，在總三萜濃度在0.1～0.7 mg/mL范圍內O2-自由基清除率測定結果成劑量效應關系，當薰衣草總三萜濃度增大到0.5 mg/mL時，O2-自由基清除率達到47.93%，當VC濃度到達0.6 mg/mL時，其O2-自由基清除率達到84.43%，薰衣草總三萜O2-自由基清除率小于陽性對照VC。

圖8 薰衣草總三萜的O2-自由基清除率Fig.8 O2- free radical clearance rate of total triterpenes from Lavandula angustifoli

3 結論

本實驗通過單因素實驗和響應面優化分析，建立二次多項式模型，理論模型擬合較好，方差分析結果表明各個因素影響程度大小順序為料液比＞超聲功率＞乙醇濃度＞超聲時間；響應面相互作用圖表明乙醇濃度與料液比、乙醇濃度與超聲時間、料液比與超聲時間交互作用極顯著；響應面優化得到最優工藝條件為乙醇濃度為89%，料液比為1:33，超聲輔助提取60 min，超聲功率為70% (445 W)，該條件下薰衣草總三萜的提取量為（39.95±0.32）mg/g，與預測值接近，表明響應面優化后工藝參數可靠。進一步對薰衣草總三萜進行體外抗氧化活性測定，其中薰衣草總三萜對DPPH自由基清除能力較強，清除率為86.83%，是同等濃度VCDPPH自由基清除率的96.25%，薰衣草總三萜OH自由基和O2-自由基清除率分別為42.06%和47.93%。

通過響應面法優化工藝能夠提取得到更多的三萜類有效成分，并具有較強的抗氧化活性，一定程度為薰衣草殘渣有效成分的利用提供了理論基礎。但未進行分離純化得到單一化合物，進一步對影響其活性的有效成分進行深入探索。