納豆菌液態發酵制備蠶蛹肽的工藝優化及其抗炎活性研究

沈圓圓，于福田，秦雅莉，陳尚里，董詩瑜，趙笑潁，劉小玲

（廣西大學輕工與食品工程學院，廣西南寧 530004）

蠶蛹是蠶絲的主要副產品，我國蠶蛹年產量達50萬噸，約占全球總產量的80%。蠶蛹的蛋白質含量為60%左右，富含18種氨基酸[1]。蠶蛹蛋白是一種營養價值較高的可食用蛋白，還有一定的藥用價值。近年來，研究發現蠶蛹蛋白和蠶蛹肽具有抗氧化[2]、降血壓[3]、降血脂[4]、抗菌[5]和免疫調節[6]等功能活性，但關于其抗炎活性的研究幾乎沒有。目前，蠶蛹資源由于深加工技術缺乏，僅用作肥料和動物飼料，甚至被作為工業廢棄物處理[7]。因此，蠶蛹的開發利用具有廣闊的發展空間，制備蠶蛹肽（silkworm pupa peptides，SPP）對提高蠶蛹資源利用率和挖掘其潛在藥用價值具有重要意義。

炎癥是機體應對刺激的一種防御反應[8]，但不受控制的炎癥會誘發多種疾病。炎癥性疾病是由于大量促炎性介質，特別是一氧化氮自由基（nitric oxide，NO）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNFα）、白 介 素1β（Interleukin-1β，IL-1β）和 白 介 素6（Interleukin-6，IL-6）等過度分泌引起的[9]。目前，常用的抗炎藥物因具有多種副作用而在實際應用中逐漸受到限制。生物活性肽具有吸收速度快、安全性高、無副作用等優點，在炎癥性疾病的防治中具有廣闊的應用前景[10]。近年來，抗炎活性肽已在多種食物蛋白中得到很好的探索，如雞肉、魚肉和大豆蛋白等[10]。目前，蠶蛹肽常用的制備方法有：酶解法、微生物發酵法、化學合成法和基因重組法。例如，LI等[11]通過使用堿性蛋白酶在50 ℃、pH9.0的條件下水解蠶蛹蛋白50 min制備得到蠶蛹肽；XU等[12]采用固相法化學合成蠶蛹肽并對其抗腫瘤活性進行研究。與其他方法相比，微生物發酵法制備蠶蛹肽操作簡便，成本較低，更易于產業化生產，應用前景廣闊[13]。

本文利用納豆菌生長過程中分泌的蛋白酶降解蠶蛹蛋白制備蠶蛹肽。在單因素實驗基礎上，通過響應面試驗篩選出最佳發酵工藝參數，并采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的RAW264.7巨噬細胞建立炎癥模型，測定NO、TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量，對蠶蛹肽的抗炎活性進行初探，以期為蠶蛹肽在醫藥、食品、農業等領域的工業應用提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

繅絲冷凍蠶蛹 廣西河池桑蠶基地；納豆菌本課題組實驗室分離保藏菌種；RAW264.7小鼠巨噬細胞 中國科學院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫；DMEM培養基 美國 Gibco公司；胎牛血清

以色列Bioind公司；脂多糖（LPS，Escherichia coli055:B5） 北京索萊寶科技有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）細胞增殖毒性檢測試劑盒 日本同仁化學研究所；一氧化氮（NO）檢測試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司；小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒 武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；氫氧化鈉等其他試劑 均為國產分析純。

T25高速分散均質機 德國IKA公司；GI80TW高壓蒸汽滅菌鍋 致微（廈門）儀器有限公司；FD-1D-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；CR21N高速冷凍離心機 日立公司；Infinite M200PRO酶標儀 奧地利TECAN公司；ZQZY-85CS振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；SQP電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；CCL-170B-8二氧化碳培養箱 新加坡藝思高科技有限公司；CKX41倒置顯微鏡 日本OLYMPUS有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 參照ZHOU等[14]的有機溶劑法對蠶蛹進行脫脂。將繅絲冷凍蠶蛹放于室溫下解凍2 h，然后將蠶蛹勻漿后凍干粉碎，過80目篩，取蠶蛹粉置于8倍體積的正己烷中，38 ℃條件下磁力攪拌5 h，8000 r/min室溫離心10 min后，棄上清液，通風櫥晾干，所得脫脂蠶蛹粉（殘油率為1.56%±0.32%）置于陰涼干燥處保存備用。

1.2.2 蠶蛹蛋白粉的制備 參照ZENG等[15]的堿溶酸沉法提取蠶蛹蛋白。脫脂蠶蛹粉→堿溶（10%（W/V），1 mol/L NaOH調pH至10.0）→45 ℃攪拌5 h→8000 r/min離心處理10 min→收集上層清液→酸沉10 min（1 mol/L HCl調pH至4.0）→8000 r/min離心處理10 min→收集沉淀→洗滌并離心2次（蒸餾水攪拌，0.1 mol/L NaOH調pH至7.0）→冷凍干燥→蠶蛹蛋白粉。

1.2.3 納豆菌液態發酵制備蠶蛹肽

1.2.3.1 納豆菌生長曲線的測定 斜面培養基：蛋白胨1.0 g、酵母浸粉0.5 g、氯化鈉1.0 g、瓊脂1.5 g、蒸餾水100 mL，1 mol/L NaOH調節pH至7.0。種子培養基：蛋白胨1.0 g、牛肉粉3.0 g、葡萄糖1.0 g、蒸餾水100 mL，1 mol/L NaOH調節pH至7.0。參考高潔等[16]的方法進行，從試管斜面上挑取2環納豆菌，立即接入種子培養基，37 ℃，160 r/min，搖床振蕩培養。將未接種培養基作為對照組，每隔2 h取出種子液測定其在600 nm處的吸光度（OD），每份樣品平行測定3次，取平均值。以培養時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制生長曲線以確定納豆菌的生長對數期，測定總時長為40 h。

1.2.3.2 種子液的制備 將從斜面培養基活化好的菌種接至種子培養基，37 ℃、160 r/min搖床振蕩培養，培養制得處于對數期的種子液。

1.2.3.3 蠶蛹肽的制備 將種子液（107～108CFU/mL）以一定比例的接種量接種至發酵培養基（蠶蛹蛋白粉3.0 g、葡萄糖1.0 g、磷酸二氫鉀0.1 g、磷酸氫二鉀0.25 g、硫酸鎂0.5 g、蒸餾水100 mL，調節pH至7.0）中，并置于適宜溫度下進行振蕩培養。待一定時間后終止發酵，9000 r/min，4 ℃，離心20 min以除去菌體沉淀和未利用的蠶蛹蛋白殘渣，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，并將其冷凍干燥，即得蠶蛹肽，置于-20 ℃下保存備用。

1.2.4 單因素實驗 以多肽得率為評價指標，分別研究各單因素對納豆菌液態發酵制備蠶蛹肽的影響。初始條件分別取：接種量4 mL、蠶蛹蛋白添加量3 g、初始pH7、發酵溫度37 °C、發酵時間32 h。選取各因素變量分別為接種量（2、3、4、5、6 mL）、蠶蛹蛋白添加量（1、2、3、4、5 g）、初始pH（5、6、7、8、9）、發酵溫度（31、34、37、40、43 °C）、發酵時間（24、28、32、36、40 h），進行單因素實驗。

1.2.5 響應面試驗 在單因素實驗的基礎上，以接種量（A）、蠶蛹蛋白添加量（B）、發酵時間（C）為自變量，以多肽得率（Y）為響應值。采用Design-Expert V 8.0.6進行Box-Behnken試驗設計，優化出納豆菌液態發酵制備蠶蛹肽的工藝。試驗因素與水平編碼如表1 所示。

1.2.6 多肽得率的測定 參照魯偉等[17]的雙縮脲法進行多肽濃度的測定。取2.5 mL發酵液于試管中，加入2.5 mL 10%三氯乙酸，混合均勻后靜置20 min，然后8000 r/min室溫離心20 min，取0.5 mL上清液于另一試管中，再加入2.0 mL雙縮脲試劑，混合均勻后靜置20 min，再次8000 r/min離心20 min，取上清液于540 nm波長處測吸光度。以加0.5 mL蒸餾水和2.0 mL雙縮脲試劑作為空白對照組。

式中：W表示多肽得率，%；c表示發酵上清液多肽濃度，mg/mL；V表示發酵液體積，mL；m表示蠶蛹蛋白添加量，mg。

1.2.7 抗炎活性

1.2.7.1 細胞培養 RAW264.7巨噬細胞在含有10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 μg/mL青霉素的DMEM中培養。將處于對數期的細胞以5×104個/孔的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，并在37 ℃、5% CO2的加濕培養箱中過夜培養，用于后續實驗[18]。

1.2.7.2 實驗分組 設置空白對照組為未經LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞，模型組為LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞，實驗組為不同濃度（50、100、150 μg/mL）蠶蛹肽處理LPS刺激的RAW 264.7巨噬細胞。每組設置6個復孔。

1.2.7.3 細胞活力的測定 通過CCK-8法測定細胞活力[19]。在無或有LPS（1 μg/mL）刺激細胞24 h建立細胞炎癥模型的情況下，用不同濃度（50、100、150 μg/mL）蠶蛹肽處理RAW 264.7巨噬細胞12 h。然后，每孔放入10 μL CCK-8溶液。在培養箱孵育1 h后，通過用酶標儀測定450 nm處的吸光度計算細胞活力，并根據下式計算：

式中：As實驗組（含有細胞的培養基、CCK-8、待測樣品）；Ac對照組（含有細胞的培養基、CCK-8、無待測樣品）；Ab空白組（不含細胞和待測樣品的培養基、CCK-8）。

1.2.7.4 蠶蛹肽對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞形態的影響 用1 μg/mL的LPS刺激細胞24 h建立細胞炎癥模型的情況下，用不同濃度（50、100、150 μg/mL）蠶蛹肽處理RAW 264.7巨噬細胞12 h。培養結束后，用倒置顯微鏡觀察并記錄細胞形態。

1.2.7.5 一氧化氮（NO）含量的測定 通過格里斯（Griess）法檢測NO含量[20]。用1 μg/mL的LPS刺激RAW 264.7巨噬細胞24 h建立炎癥模型，然后用不同濃度（50、100、150 μg/mL）的蠶蛹肽處理RAW 264.7巨噬細胞12 h。培養結束后收集細胞培養液上清，用NO檢測試劑盒進行NO含量的測定。簡而言之，將50 μL上清液鋪在96孔板中，并在其中加入等量的Griess試劑，然后用酶標儀測定540 nm處的吸光度。使用亞硝酸鈉（NaNO2）標準品繪制標準曲線（0～100 μmol/L），根據標準曲線計算NO的含量。

1.2.7.6 促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量的測定通過ELISA法檢測促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。根據小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6的ELISA試劑盒使用說明書，測定細胞培養液上清中促炎因子的水平。

1.3 數據處理

所有實驗均重復3次，結果用平均值±標準差表示；采用SPSS Statistics26.0軟件對每一組數據進行單因素方差分析（ANOVA），然后進行顯著性檢驗，P＜0.05認為具有顯著性差異；采用Design Expert 8.0.6軟件設計組合試驗和利用Origin 9.8進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 納豆菌生長曲線

圖1為納豆菌在種子培養基上的生長曲線。由圖可知，納豆菌的生長曲線大致可分為四個階段，在0～4 h處于遲緩期，4～12 h處于對數生長期，12～34 h處于穩定期，34 h以后進入衰亡期。用于發酵的納豆菌應選用處于對數生長期的菌種，因為處于該階段的菌種生長速率最快、代謝旺盛、酶系豐富活躍、外界適應能力強，因此，選取培養12 h的菌種作為后續實驗的種子液。

圖1 納豆菌生長曲線Fig.1 The growth curve of Bacillus natto

2.2 單因素實驗

2.2.1 接種量對多肽得率的影響 如圖2所示，隨著接種量的不斷增加，多肽得率呈現先升高后下降的趨勢，接種量達到4 mL時多肽得率最佳。這可能與納豆菌的產酶量以及數量有關[16]，接種量在2～4 mL時，隨著接種量的增加，納豆菌分泌的蛋白酶也逐漸增多，導致豐富的蛋白酶水解底物而產生大量的蠶蛹肽；接種量4～6 mL時，納豆菌的大量繁殖需要消耗更多的營養物質，而后期營養物質不足以滿足納豆菌的生長繁殖和產酶，酶解所得的蠶蛹肽優先供自身生長發育，致使多肽得率降低。因此，選取3～5 mL的接種量作為后續響應面試驗水平范圍。

圖2 接種量對多肽得率的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on the yield of polypeptide

2.2.2 蠶蛹蛋白添加量對多肽得率的影響 如圖3所示，隨著蠶蛹蛋白添加量的增加，多肽得率呈現先升高后下降的趨勢，蠶蛹蛋白添加量在3 g時達到最大值，多肽得率為13.04%±0.09%。前期蠶蛹蛋白添加量過低時，納豆菌所需的營養物質不足[16]，影響發酵速度，導致多肽得率較低。后期伴隨著蠶蛹蛋白添加量的增加，納豆菌會不斷分解蠶蛹蛋白，因納豆菌本身特性而產生大量粘稠性物質。發酵液的粘度過大會造成底物與蛋白酶無法充分接觸[21]，進而影響納豆菌酶解產生多肽。另外，納豆菌屬于嗜氧菌，發酵液粘度過大供氧不足，產酶量減少，酶活降低，多肽得率降低。因此，選取2～4 g的蠶蛹蛋白添加量作為后續響應面試驗水平范圍。

圖3 蠶蛹蛋白添加量對多肽得率的影響Fig.3 Effect of silkworm pupa protein addition on the yield of polypeptide

2.2.3 初始pH對多肽得率的影響 如圖4所示，隨著初始pH的增加，多肽得率呈現先升高后下降的趨勢，初始pH為7時達到最大值，多肽得率為13.06%±0.06%。這可能是因為pH的改變會影響納豆菌的生長發育、肽的積累及其穩定性；pH也會影響酶的解離程度、底物蠶蛹蛋白的電荷性質、結構和功能，這些因素都會降低酶的活性。因此，納豆菌液態發酵制備蠶蛹肽的最佳的初始pH為7，過高或過低的pH都不利于蠶蛹肽的生成。

圖4 初始pH對多肽得率的影響Fig.4 Effect of initial pH on the yield of polypeptide

2.2.4 發酵溫度對多肽得率的影響 如圖5所示，發酵溫度的升高會對多肽得率有一定的影響。當發酵溫度為37 ℃時，多肽得率最高為13.22%±0.05%。這可能與納豆菌的自身特性有關，納豆菌生長溫度范圍廣，最高可達45～55 ℃，最低可達5～20 ℃。當納豆菌處于最適生長溫度時有利于其生長發育，同時也更有利于其產生大量蛋白酶。因此，納豆菌液態發酵制備蠶蛹多肽的最佳發酵溫度為37 ℃。

圖5 發酵溫度對多肽得率的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on the yield of polypeptide

2.2.5 發酵時間對多肽得率的影響 由圖6可知，隨著發酵時間的不斷增加，多肽得率呈現先升高后下降的趨勢，發酵時間在第36 h時達到最大值，多肽得率為12.94%±0.04%。這可能與納豆菌的產酶有關，隨著發酵時間的增加，納豆菌產酶量不斷增多，蠶蛹蛋白得到充分的水解；但在發酵后期，前期得到的多肽會進一步水解，多肽可能被水解為二肽或游離氨基酸。因此，選取32～40 h的發酵時間作為后續響應面試驗水平范圍。

圖6 發酵時間對多肽得率的影響Fig.6 Effect of fermentation time on the yield of polypeptide

2.3 蠶蛹肽發酵工藝響應面優化

在單因素實驗結果的基礎上，以接種量（A）、蠶蛹蛋白添加量（B）和發酵時間（C）3個影響較大的因素為自變量，多肽得率（Y）為響應值，采用Design Expert 8.0.6軟件設計了三因素三水平的響應面試驗。Box-Behnken試驗設計與結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experimental design

對接種量（A）、蠶蛹蛋白添加量（B）、發酵時間（C）3個單因素進行二次多項式回歸擬合，得出多肽得率（Y）回歸方程：

對回歸模型進行方差分析和差異顯著性檢驗如表3所示，回歸模型高度顯著（P＜0.0001），失擬項不顯著（P=0.0886＞0.05），說明模型建立成功。決定系數R2為0.9753，說明多肽得率與回歸模型預測結果有較高一致性。校正決定系數R2Adj為0.9435，說明響應值多肽得率有94.35%受模型中所涉及的各因素的影響[22]。根據F值可知各因素對多肽得率影響的主次順序為：B＞A＞C，即蠶蛹蛋白添加量＞接種量＞發酵時間。納豆菌液態發酵制備蠶蛹多肽過程中蠶蛹蛋白添加量（B）對多肽得率影響達到高度顯著水平（P＜0.001），接種量（A）對多肽得率影響達到極顯著水平（P＜0.01），發酵時間（C）對多肽得率影響達到顯著水平（P＜0.05）。交互項AB、AC和BC對多肽得率影響均不顯著（P＞0.05）。二次項B2和C2對多肽得率影響都達到高度顯著水平（P＜0.001），A2對多肽得率影響不顯著（P＞0.05）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

響應面三維曲面圖和等高線圖（圖7）可直觀反映各因素間交互作用對多肽得率的影響結果。由圖7（a）可知，發酵時間位于中心水平時，蠶蛹蛋白添加量較接種量對多肽得率的影響更大，當接種量在3.5～5.0 mL、蠶蛹蛋白添加量在2.0～3.3%范圍內多肽得率存在最大值；由圖7（b）可知，蠶蛹蛋白添加量位于中心水平時，發酵時間較接種量對多肽得率的影響更大，當接種量在3.7～5.0 mL、發酵時間在33～37 h范圍內多肽得率存在最大值；由圖7（c）可知，接種量位于中心水平時，發酵時間較蠶蛹蛋白添加量對多肽得率的影響更大，當蠶蛹蛋白添加量在2.0～3.3 g、發酵時間在34～38 h范圍內多肽得率存在最大值。

圖7 因素間交互作用對多肽得率影響的響應面及等高線Fig.7 Response surface and contour lines of the interaction of various factors on the yield of polypeptide

2.4 驗證實驗

經響應面軟件Design-Expert 8.0.6分析所得最優工藝條件為：接種量5.0 mL、蠶蛹蛋白添加量2.61 g、發酵時間35.37 h。為驗證響應面預測結果的可靠性，并考慮實際操作中條件的設置，按照接種量5.0 mL、蠶蛹蛋白添加量2.6 g、發酵時間35.4 h進行3次驗證實驗。驗證實驗所得多肽得率為14.58%±0.16%，與預測值（14.60%）相近，證明用響應面法優化蠶蛹多肽得率的回歸模型可靠。

2.5 蠶蛹肽的抗炎活性

2.5.1 蠶蛹肽對RAW264.7巨噬細胞活力的影響由圖8可知，LPS及蠶蛹肽對RAW264.7巨噬細胞均無毒性。RAW264.7巨噬細胞經1 μg/mL的LPS作用24 h后，其細胞存活率為101.33%±0.41%，說明LPS不影響RAW264.7巨噬細胞的增殖活力（P＜0.05）。在50～150 μg/mL濃度范圍內，蠶蛹肽對RAW264.7巨噬細胞有顯著的增殖作用（P＜0.05），且有一定的劑量依賴性。因此，選用濃度為50、100、150 μg/mL的蠶蛹肽進行后續實驗。

圖8 蠶蛹肽對RAW264.7巨噬細胞活力的影響Fig.8 Effect of silkworm pupa peptides on the activity of RAW264.7 macrophages

2.5.2 蠶蛹肽對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞活力的影響 圖9為不同濃度蠶蛹肽對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞活力的影響。在50～150 μg/mL濃度范圍內，蠶蛹肽對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞活力有一定的促進作用。當濃度為150 μg/mL時，細胞存活率達到最大值124.47%±1.81%。這主要是由于生物活性肽具有安全性高、分子量小、易吸收等特點，可以被細胞用作營養物質，促進細胞生長[21]。

圖9 蠶蛹肽對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞活力的影響Fig.9 Effect of silkworm pupa peptides on the activity of RAW264.7 macrophages induced by LPS

2.5.3 蠶蛹肽對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞形態的影響 如圖10（a）所示，正常的RAW264.7巨噬細胞接近圓形或橢圓形且表面光滑。當用1 μg/mL的LPS誘導RAW264.7巨噬細胞建立炎癥模型后，細胞逐漸變為梭形，細胞表面存在皺紋和大量延伸的偽足，見圖10（b）。此時的細胞大部分為樹突狀細胞，細胞中的氣泡和顆粒也增加并分散在系統中[23]。圖10（c）～（e）為不同濃度蠶蛹肽處理炎癥細胞的實驗組，從中可以看出，隨著樣品濃度的增加細胞表面逐漸變得光滑、收縮，偽足也不斷減少，說明蠶蛹肽可有效緩解炎癥。當蠶蛹肽的濃度達到150 μg/mL時，大部分細胞的形態恢復正常而且細胞數量明顯增加，說明蠶蛹肽可促進細胞的生長繁殖。

圖10 蠶蛹肽對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞形態的影響Fig.10 Effect of silkworm pupa peptides on morphology of RAW264.7 macrophages induced by LPS

2.5.4 蠶蛹肽對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞NO釋放量的影響 NO自由基在炎癥反應中起著至關重要的作用[24]。正常情況下，巨噬細胞很少表達誘導型一氧化氮合酶（iNOS）；在炎癥過程中，iNOS將大量表達并產生NO，從而導致細胞損傷和炎癥性疾病。細胞的NO分泌量可以間接反映炎癥水平，因此用LPS刺激RAW264.7巨噬細胞建立細胞炎癥模型，通過測定NO水平來評估蠶蛹肽對炎癥的作用[25]。如圖11所示，與對照組相比，經LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞NO釋放量極顯著增加（P＜0.01），說明LPS誘導的炎癥模型建立成功。與模型組相比，經50～150 μg/mL濃度范圍內的蠶蛹肽治療12 h后，極顯著降低了NO的釋放量（P＜0.01）。不同濃度的蠶蛹肽均可減少NO的生成，并且呈劑量依賴性。當蠶蛹肽濃度為150 μg/mL時，與模型組相比，NO的釋放量降低了49.98%。

圖11 蠶蛹肽對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞NO釋放量的影響Fig.11 Effect of silkworm pupa peptides on NO release from RAW264.7 macrophages induced by LPS

2.5.5 蠶蛹肽對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的影響 除NO外，一些炎癥因子如TNF-α、IL-1β和IL-6在類風濕性關節炎、結腸炎等炎癥性疾病的發病機制中也起著關鍵作用[26]。TNF-α可以通過持續刺激誘導多種炎癥基因的轉錄，促進白細胞遷移，引起上皮細胞凋亡，從而引起全身炎癥[27]。IL-1β對巨噬細胞具有趨化作用，大量IL-1β侵入血液會引起發熱[28]。IL-6在炎癥早期產生，可促進T細胞的分化和活化，在急性和慢性炎癥性疾病中都是關鍵的介質[29]。阻斷TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的信號傳導可有效治療炎癥性疾病，因此可將它們作為評價抗炎活性的指標。如圖12所示，未經LPS刺激的空白組細胞中TNF-α（圖a）、IL-1β（圖b）和IL-6（圖c）的檢出量很低。經LPS刺激后，蠶蛹肽以劑量依賴性方式極顯著降低LPS誘導的RAW264.7細胞中IL-1β和IL-6的分泌（P＜0.01），蠶蛹肽對IL-1β和IL-6的最大抑制率分別為42.58%、30.79%。但是，蠶蛹肽不以劑量依賴性方式降低TNF-α的分泌。這可能是由于蠶蛹肽對IL-1β和IL-6的抑制效果比TNF-α更敏感[30]。總的來說，蠶蛹肽的抗炎活性與抑制炎癥因子有關。

圖12 蠶蛹肽對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中炎癥因子TNF-α（a）、IL-1β（b）和IL-6（c）分泌的影響Fig.12 Effect of silkworm pupa peptides on secretion of inflammatory factors TNF-α（a）, IL-1β（b）and IL-6（c）in RAW264.7 macrophages induced by LPS

3 結論

本研究通過響應面試驗優化得到了納豆菌液態發酵制備蠶蛹肽的最佳工藝條件：接種量5.0 mL、蠶蛹蛋白添加量2.6 g、初始pH7.0、發酵溫度37 ℃和發酵時間35.4 h，此條件下的多肽得率為14.58%。此外，最佳發酵工藝參數組合下獲得的蠶蛹肽在LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞體外炎癥模型中表現出較好的抗炎活性，在50～150 μg/mL濃度范圍內，蠶蛹肽對RAW264.7巨噬細胞無毒性，并且對細胞有顯著的增殖作用（P＜0.05）。蠶蛹肽可顯著抑制LPS誘導的RAW264.7細胞上清液中NO、IL-1β和IL-6的分泌（P＜0.05），且呈劑量依賴性。本研究為微生物發酵法制備抗炎活性肽提供一定的理論基礎。經發酵得到的蠶蛹抗炎活性肽是一種混合物，有待于進一步分離、純化、鑒定并對其作用機理進行探究。