金花茶花總黃酮雙水相提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性分析

徐嘉鴻，劉美美，戚滇杰，俞 杰, ，許曉路，ZHYLKO Viachaslau

（1.浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310015；2.白俄羅斯國立大學(xué)國際薩哈羅夫環(huán)境研究所，明斯克220070）

金花茶組植物（Camelliasect.Chrysantha） 是山茶科（Theaceae） 山茶屬（Camellia）植物，常綠灌木或小喬木[1]。金花茶花是茶花家族中唯一花瓣金黃色的珍稀物種，且花中含有黃酮、茶多酚、茶多糖、皂苷、茶氨酸等活性成分[2]，在山茶類群中享有“植物界大熊貓”、“茶族皇后”之美譽(yù)。

植物體中的黃酮具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松、抗輻射等多種藥理作用[3-7]，工業(yè)應(yīng)用前景廣闊。關(guān)于金花茶花黃酮化合物的提取已有初步研究，然而，現(xiàn)有方法主要是基于乙醇或乙醇/水體系進(jìn)行的傳統(tǒng)溶液提取[8-9]，且相應(yīng)研究報(bào)道較少。雙水相提取技術(shù)是一種新型的萃取分離技術(shù)，根據(jù)物質(zhì)在互不相溶兩相間溶解性的差異，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分的萃取和分離，被廣泛用于生物化學(xué)產(chǎn)品的分離純化[10-11]。與傳統(tǒng)方法相比，雙水相提取技術(shù)具有操作條件溫和、易于工業(yè)放大、成本低、過程連續(xù)化等優(yōu)點(diǎn)。目前，雙水相體系已經(jīng)有效應(yīng)用于黃酮類化合物[12-14]的提取。但雙水相體系在金花茶花總黃酮中的提取應(yīng)用尚未見公開報(bào)道。

綜上，本研究采用PEG/（NH4）2SO4雙水相體系，在室溫（25 ℃）下以超聲波輔助提取金花茶花總黃酮，以黃酮的萃取率為指標(biāo)，考察PEG相對分子量、乙醇濃度、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間等因素的影響，采用正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化探索，并研究黃酮提取物的抗氧化活性，以期為金花茶的深度開發(fā)和綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金花茶花 購自廣西防城港；蘆?。?5%）、槲皮素（98.5%）、山奈酚（97%）等標(biāo)準(zhǔn)品 阿拉丁試劑（上海）有限公司；PEG平均相對分子質(zhì)量分別為600、1000、1500、2000 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈 色譜純，美國TEDIA試劑有限公司；無水乙醇、硫酸銨、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、磷酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、七水合硫酸亞鐵、水楊酸、抗壞血酸（Vc）等試劑 分析純，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；雙氧水（30%質(zhì)量濃度） 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；去離子水 為實(shí)驗(yàn)室自制。

L6S紫外分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；電子分析天平CPA225D分析天平 德國賽多利斯集團(tuán)公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 杭州慧創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司；SK2200H超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；TDZ5-WS型離心機(jī) 長沙湘銳離心機(jī)有限公司；DZF型真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；P230II型高效液相色譜儀 大連依利特分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PEG/（NH4）2SO4雙水相體系相圖制作 在25 ℃下，用Albertson濁點(diǎn)法[15]測定并制作由PEG 600、PEGl000、PEG1500、PEG2000和（NH4）2SO4溶液所形成的相圖。

稱取3.5 g PEG600配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%的溶液，定量滴加40%的（NH4）2SO4溶液至混合溶液出現(xiàn)渾濁狀態(tài)，記錄滴入的硫酸銨質(zhì)量，加水使體系重新變?yōu)槌吻鍫顟B(tài)，記錄加入水的質(zhì)量，然后計(jì)算出此時(shí)（NH4）2SO4和PEG600在體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即得相圖中一個(gè)點(diǎn)。不斷重復(fù)上述操作，以（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，PEG600的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)作圖，即可得到PEG600/（NH4）2SO4雙節(jié)線圖。

按照上述操作，分別測定并得到PEGl000、PEG1500、PEG2000和（NH4）2SO4的雙節(jié)線圖。

1.2.2 PEG/（NH4）2SO4雙水相提取金花茶花總黃酮

1.2.2.1 原料預(yù)處理 將金花茶花置于60 ℃真空干燥箱恒溫脫水干燥3 h，粉碎制成粉末，密封裝于自封袋中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 金花茶花總黃酮提取工藝 PEG/（NH4）2SO4雙水相提取金花茶花總黃酮提取工藝如下[14,16]：稱取0.50 g經(jīng)預(yù)處理后的金花茶花粉末于50 mL錐形瓶中，加入80%乙醇25 mL，超聲（200 W）30 min，離心（1500 r/min，15 min）分離得粗提液。固定雙水相體系總質(zhì)量為10 g，在10 mL離心管中加入一定量的PEG和（NH4）2SO4，加入乙醇粗提液2 mL，然后加水至10 g。搖勻，離心（1500 r/min，15 min），靜置使兩相分離。分別測定上下相的體積及上下相中的黃酮含量。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) PEG相對分子質(zhì)量對總黃酮分配行為的影響：在PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，乙醇濃度80%，超聲時(shí)間30 min條件下，分別設(shè)置PEG相對分子質(zhì)量為600、1000、1500、2000，測定金花茶花總黃酮的分配系數(shù)K和萃取率Y。

乙醇濃度對總黃酮分配行為的影響：在PEG 600質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，超聲時(shí)間30 min的條件下，分別設(shè)定乙醇濃度為0%、20%、40%、60%、80%、100%，測定金花茶花總黃酮的分配系數(shù)K和萃取率Y。

PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)對總黃酮分配行為的影響：在（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，乙醇濃度80%，超聲時(shí)間30 min的條件下，分別設(shè)置PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%、15%、18%、21%，測定金花茶花總黃酮的分配系數(shù)K和萃取率Y。

（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對總黃酮分配行為的影響：在PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%，乙醇濃度80%，超聲時(shí)間30 min的條件下，分別設(shè)置（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14%、16%、18%、20%，22%，測定金花茶花總黃酮的分配系數(shù)K和萃取率Y。

超聲時(shí)間對總黃酮分配行為的影響：在PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)18%，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，乙醇濃度80%的條件下，分別設(shè)置超聲時(shí)間為0、15、30、45 min，測定金花茶花總黃酮的分配系數(shù)K和萃取率Y。

1.2.4 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)、（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇濃度、超聲時(shí)間四因素三水平[L9（34）]進(jìn)行正交試驗(yàn)，以金花茶花總黃酮的萃取率為指標(biāo)，優(yōu)選出最佳提取條件。正交試驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì)如表1所示。

1.2.5 金花茶花總黃酮含量測定 實(shí)驗(yàn)采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測定總黃酮含量[17]。取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液和金花茶花提取液，以乙醇溶液為空白對照，紫外分光光度計(jì)在200～700 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品和金花茶花提取液在510 nm 波長下均有最大吸收，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，確定選用510 nm 為檢測波長。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱取5 mg蘆丁于50 mL容量瓶中，加無水乙醇至溶解后，用60%濃度的乙醇定容至刻度，搖勻后，得到質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。取6只標(biāo)記好的10 mL容量瓶分別加入0、1、2、3、4、5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，加水至5 mL，加入5%濃度的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻后靜置5 min，加入10%濃度的Al（NO3）3·9H2O溶液 0.3 mL，搖勻后靜置6 min，再加入4%濃度的NaOH溶液2 mL，加水稀釋至刻度線，搖勻后靜置10 min。以第一管為對照組在510 nm處測定吸光度值。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

按上述蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中的方法，以稀釋后的金花茶花提取液代替蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定其吸光度。按照（1）～（3）式計(jì)算金花茶花總黃酮的分配系數(shù)（K）和萃取率（Y），按照（4）式計(jì)算金花茶花總黃酮得率。

式中，R是雙水相體系中上、下相的體積比；V1是雙水相體系中上相的體積，mL；V2是雙水相體系中下相的體積，mL；K為雙水相體系的分配系數(shù)；C1是雙水相體系中上相所含的黃酮濃度，mg/mL；C2是雙水相體系中下相所含黃酮濃度，mg/mL；Y為雙水相體系中金花茶花總黃酮的萃取率，%；n為稀釋倍數(shù)；M為金花茶花粉的質(zhì)量，mg。

1.2.6 HPLC分析 采用HPLC法對金花茶花提取物中的蘆丁、槲皮素和山奈酚等三個(gè)黃酮化合物進(jìn)行定性定量分析。

制樣：精密稱取適量蘆丁、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)樣品，分別配制成濃度為0.306、0.256、0.258 mg/mL的乙醇溶液，按體積比為1:1:1混合后，得到蘆丁、槲皮素和山奈酚濃度分別為0.102、0.085、0.086 mg/mL的混標(biāo)溶液；按照1.2.4的方法所選出的優(yōu)化條件，制備金花茶花黃酮提取物，加無水乙醇稀釋，過0.22 μm濾膜后，得到待測樣品溶液。

色譜條件[18]：Hypersil ODS2 C18 色譜柱（4.6 mm×200 mm, 5 μm）；流動相（A）為0.2%磷酸溶液，流動相（B）為乙腈；梯度洗脫（0～5 min，20%～22%B；5～10 min，22%～25%B；10～20 min，25%～35%B；20～25 min，35%～40%B；25～30 min，40%～55%B；30～35 min，55%～20%B）；檢測波長為360 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；運(yùn)行時(shí)間為35 min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取混標(biāo)溶液2、5、10、15、20 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣，以各組分的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 金花茶花總黃酮抗氧化性能研究

1.2.7.1 DPPH·清除能力測定 參照文獻(xiàn)的方法[19]，略有改動。按照1.2.4的方法所選出的優(yōu)化條件，提取金花茶花總黃酮，得到黃酮質(zhì)量濃度分別為0.065、0.163、0.26、0.358、0.455、0.553、0.65 mg/mL的樣品溶液。在具塞試管中加入2 mL樣品溶液，2 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液，在室溫下，避光反應(yīng)30 min，測定其在517 nm波長下的吸光值，即為Ai；以2 mL無水乙醇代替樣品溶液按照相同方法測定吸光值，即為A0；以2 mL無水乙醇代替DPPH溶液，重復(fù)上述步驟測定吸光值，即為Aj。自由基清除率（YA）按式（5）計(jì)算:

1.2.7.2 OH·清除能力測定 按照文獻(xiàn)的方法[20]，略有改動。按照1.2.4的方法所選出的優(yōu)化條件，提取金花茶花總黃酮，得到黃酮質(zhì)量濃度分別為0.325、0.488、0.65、0.813、0.975、1.14、1.3、1.46 mg/mL的樣品溶液。在具塞試管中依次加入2 mL 9 mmol /L的FeSO4溶液，2 mL樣品溶液，再分別加入2 mL 9 mmol/L的水楊酸溶液和2 mL 8 mmol/L的 H2O2溶液，搖勻后靜置30 min。測定其在510 nm處的吸光值，即為Ai；以2 mL去離子水代替待測樣品溶液按照相同方法測定吸光值，即為A0；以2 mL去離子水代替H2O2溶液，重復(fù)上述步驟測定吸光值，即為Aj。自由基清除率（YA）按式（5）計(jì)算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin8.0數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和圖表制作，采用正交設(shè)計(jì)助手iiv3.1軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析，采用Excel進(jìn)行相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分析。實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)重復(fù)測定三次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG600/（NH4）2SO4雙水相體系相圖

PEG600/（NH4）2SO4雙水相體系相圖如圖1所示。曲線上的點(diǎn)為臨界點(diǎn)，單相區(qū)在曲線下方，體系為均相，無相分離；兩相區(qū)在曲線上方。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，PEG的分子量越大，形成兩相所需的PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)越小，越容易形成雙水相體系[21]。而PEG分子量越高，黏度越高，相分離時(shí)間就越長[14]。在PEG相對分子量固定、質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定的情況下，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低，體系不能形成兩相；而（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，則會導(dǎo)致鹽析出。因此，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)應(yīng)選擇在曲線上方的合理區(qū)域。

圖1 PEG600/（NH4）2SO4雙水相體系相圖Fig.1 Phase diagram of PEG600/（NH4）2SO4 aqueous twophase system

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 PEG相對分子質(zhì)量的影響 PEG相對分子質(zhì)量對金花茶花總黃酮分配行為的影響如表2所示。由表可知，隨著PEG分子量的增加，上下相的體積比R減小。PEG600的分配系數(shù)K和萃取率Y都較其它相對分子質(zhì)量的PEG要大，可能的原因是PEG相對分子質(zhì)量小時(shí)，體系的黏度低，傳質(zhì)阻力小[22]。當(dāng)PEG的相對分子質(zhì)量大于1000時(shí)，隨著其相對分子質(zhì)量的增大，K值逐漸增大，可能的原因是其空間阻力增大，因此，疏水性增大，更利于黃酮類化合物在上相的分配[22]；然而，萃取率無明顯變化，說明此時(shí)PEG相對分子質(zhì)量對萃取率已無明顯影響。由上可知，PEG600的萃取效果最好，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用PEG600做進(jìn)一步研究。

表2 PEG相對分子質(zhì)量對金花茶花總黃酮分配的影響Table 2 Effect of PEG molecular weight on the distribution of total flavonoids from the flowers of Camellia chrysantha

2.2.2 乙醇濃度的影響 乙醇濃度對金花茶花總黃酮分配行為的影響如表3所示。由表可知，隨著粗提液乙醇濃度的增加，上下相的體積比R不斷增加，這是因?yàn)橐掖贾饕植荚谏舷郲16]，且乙醇具有一定的親水性。分配系數(shù)K和萃取率Y隨著乙醇濃度的增加先增加然后下降，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，達(dá)到最大值。這是因?yàn)椋欢ǖ囊掖紳舛瓤商岣唿S酮化合物的溶解度并有利于其在上相中的分配，隨著乙醇濃度進(jìn)一步增加，上相非極性增加，而黃酮苷類物質(zhì)含有具極性的糖分子結(jié)構(gòu)，此外，一些脂溶性有機(jī)物的溶解度也會增加，從而會抑制黃酮類化合物在粗提液中的溶出量以及在雙水相體系中上相的分配[23]。由上可知，較佳的乙醇濃度為80%。

表3 乙醇濃度對金花茶花總黃酮分配的影響Table 3 Effect of ethanol concentration on the distribution of total flavonoids from the flowers of Camellia chrysantha

2.2.3 PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)對金花茶花總黃酮分配行為的影響如表4所示。由表可知，隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，上下相的體積比R逐漸增加，分配系數(shù)K和萃取率Y也隨之增大。隨著PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，其捕獲鹽相中水分子的能力隨之加強(qiáng)，上相的體積則隨之增大，疏水性增加，從而有利于極性較小的黃酮化合物在上相的分布，因此，分配系數(shù)和萃取率均逐步增大[14]。當(dāng)PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于18%，萃取率增加不明顯，且當(dāng)PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于21%時(shí)，會有鹽析出。綜合考慮成本的基礎(chǔ)上，選取PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

表4 PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)對金花茶花總黃酮分配的影響Table 4 Effect of mass fraction of PEG600 on the distribution of total flavonoids from the flowers of Camellia chrysantha

2.2.4 （NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響 （NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對金花茶花總黃酮分配行為的影響如表5所示。由表可知，隨著（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，上下相的體積比R逐漸減小，與文獻(xiàn)的研究結(jié)論一致[14]，黃酮的分配系數(shù)K和萃取率Y先增加后減小，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，達(dá)到最大值。這是由于隨著（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，上相中PEG600的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐步增加，從而有利于黃酮類物質(zhì)的萃取。進(jìn)一步提高（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)，（NH4）2SO4在上相中的含量也隨之增加，從而不利于黃酮類物質(zhì)的萃取[21]。因此，選取硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

表5 （NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對金花茶花總黃酮分配的影響Table 5 Effect of mass fraction of (NH4)2SO4 on the distribution of total flavonoids from the flowers of Camellia chrysantha

2.2.5 超聲時(shí)間的影響 超聲時(shí)間對金花茶花總黃酮分配行為的影響如表6所示。由表可知，隨著超聲時(shí)間的延長，黃酮的分配系數(shù)K和萃取率Y先逐步增加，當(dāng)超聲時(shí)間大于30 min時(shí)，分配系數(shù)和總黃酮萃取率略有減小的趨勢。這可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的增加，細(xì)胞破碎更完全，更好地促進(jìn)了黃酮物質(zhì)的溶出以及在上下相的分配，但隨著超聲時(shí)間達(dá)到一定值后進(jìn)一步增加，會破壞黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)[6]。因此，上述條件下的最佳超聲時(shí)間為30 min。

表6 超聲時(shí)間對金花茶花總黃酮分配的影響Table 6 Effect of ultrasonic time on the distribution of total flavonoids from the flowers of Camellia chrysantha

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表7。由表可知，根據(jù)極差R分析，各因素對金花茶花黃酮類化合物分布的影響順序?yàn)锳＞D＞C＞B，即PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞超聲時(shí)間＞乙醇濃度＞（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)。最優(yōu)條件是A3B2C2D2，即PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)19%，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，乙醇濃度80%，超聲時(shí)間30 min。所得的組合為實(shí)驗(yàn)組別以外的組合，因此需要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)三次操作，萃取率分別為98.30%、98.41%、98.78%，平均值98.50%，大于實(shí)驗(yàn)表中的任何一組，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.2553%，重現(xiàn)性好，具有較好的穩(wěn)定性。在此條件下，總黃酮的得率為13.54%，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果接近[1,9]。

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of the orthogonal experiments

2.4 HPLC分析

由文獻(xiàn)報(bào)道[8]可知，蘆丁、槲皮素和山奈酚為金花茶花中的代表性黃酮類化合物。圖2為樣品溶液和混標(biāo)溶液的HPLC圖。根據(jù)圖中各組分的峰型及保留時(shí)間可知，樣品中含有蘆丁、槲皮素和山奈酚等三個(gè)黃酮化合物。經(jīng)定量分析，金花茶花中蘆丁為7.15 mg/g，槲皮素為1.23 mg/g，山奈酚為2.66 mg/g。

圖2 樣品溶液（A）和混標(biāo)溶液（B）的液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the sample solution （A） and the mixed standard sample solution （B）

2.5 金花茶花黃酮提取物抗氧化性能評價(jià)

2.5.1 DPPH·清除能力 由圖3可知，VC清除DPPH·能力隨濃度增加而升高，當(dāng)濃度為0.358 mg/mL時(shí)，清除率已達(dá)到95.63%，繼續(xù)增大濃度清除率無明顯變化。金花茶花黃酮提取物清除DPPH·能力隨濃度的增加而升高，當(dāng)樣品濃度為0.455 mg/mL時(shí)，對DPPH·的清除率為86.63%，為VC水平的91%，說明金花茶花黃酮提取物對DPPH·有較強(qiáng)的清除能力[24]，文獻(xiàn)[9]報(bào)道當(dāng)金花茶花提取物濃度為2 mg/mL時(shí)，對DPPH·的清除率為78.05%。采用SPSS 20.0軟件分析，VC清除DPPH·的IC50為0.054 mg/mL，金花茶花黃酮提取物清除DPPH·的IC50為0.070 mg/mL。

圖3 金花茶花黃酮提取物和VC對DPPH·的清除能力測定Fig.3 Determination of DPPH· radical scavenging ability of the flavonoid extract from the flowers of Camellia chrysantha and VC

2.5.2 OH·清除能力 由圖4可知，在所測定濃度范圍內(nèi)，VC對OH·始終保持很高的清除能力，當(dāng)濃度大于0.65 mg/mL時(shí)，清除率幾乎接近100%[20]。金花茶花黃酮提取物對OH·表現(xiàn)出一定的清除能力，且在一定的濃度范圍內(nèi)，對OH·清除能力與濃度呈明顯的量效關(guān)系[25]。當(dāng)樣品濃度為1.46 mg/mL時(shí)，對OH·的清除率為75.23%，表現(xiàn)出較好的清除能力[26]，文獻(xiàn)[25]報(bào)道當(dāng)金花茶花黃酮提取物濃度為1.2 mg/mL時(shí)，對OH·的清除率為71.3%。采用SPSS 20.0軟件分析，VC清除OH·的IC50為0.176 mg/mL，金花茶花黃酮提取物清除OH·的IC50為0.679 mg/mL。

圖4 金花茶花黃酮提取物和VC對OH·的清除能力測定Fig.4 Determination of OH· radical scavenging ability of the flavonoid extract from the flowers of Camellia chrysantha and VC

3 結(jié)論

考察了室溫下超聲波輔助金花茶花總黃酮在PEG/（NH4）2SO4雙水相體系中的分配規(guī)律。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝流程。最佳的萃取條件為PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)19%，（NH4）2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%，乙醇濃度80%，超聲時(shí)間30 min。在此條件下，總黃酮的萃取率為98.50%，得率為13.54%。該工藝在溫和的條件下進(jìn)行，具有操作簡單、綠色的優(yōu)點(diǎn)，易于工業(yè)化。此外，以DPPH·和OH·的清除率為指標(biāo)，考察了黃酮提取物的抗氧化性能。結(jié)果表明，金花茶花黃酮提取物清除DPPH·的IC50為0.070 mg/mL，清除OH·的IC50為0.679 mg/mL，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為后續(xù)黃酮化合物等天然產(chǎn)物的提取及抗氧化性能研究提供參考，具有一定的理論意義及工業(yè)化應(yīng)用價(jià)值。