冷等離子體對果蔬冷庫微生物群落的影響

方 瓊，曹建康, ，趙玉梅，仲崇山，劉彧希

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083；2.中國農業大學信息與電氣工程學院，北京 100083）

果蔬冷庫是指利用降溫設施來維持物品所需的適宜濕度和低溫環境的一種貯藏設施，主要用來存放水果和蔬菜等農產品，在一定時間內確保其品質[1-2]。我國是果蔬生產和消費大國[3]，冷庫在果蔬的冷鏈流通過程中起到至關重要的作用[4]。低溫雖然可抑制大多數微生物的生長繁殖，但卻無法做到有效殺滅微生物。因此冷藏環境中的病原微生物仍會使果蔬在貯藏期間及解除低溫后發生病害。產品腐爛變質或產生真菌毒素[5]，不僅會造成經濟損失[6]，還可能威脅人類的生命健康[7]。因此，了解果蔬冷庫環境中的微生物組成，采取合適的殺菌手段對冷庫中的微生物群落結構進行干預，是保障果蔬冷庫整體保鮮水平和貯藏質量的一項重要工作。

近幾年，冷等離子體技術作為一種非熱消毒殺菌技術已逐漸應用于食品行業[8-9]。冷等離子體（cold plasma, CP）處理產生的活性基團和離子能在較短時間內有效抑制包括細菌、酵母、霉菌甚至是真菌孢子在內的多種微生物的生長并導致其死亡，且其安全無殘留，在食品中有良好的應用前景[10-12]。研究表明，冷等離子體對果蔬、肉類、水產品及谷物等食品表面的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌[13]、沙門氏菌、單增李斯特菌、黃曲霉菌[14]、青霉菌、白色念珠菌[15]等食源性致病菌均有良好的殺滅效果。現有的以冷等離子體及果蔬為研究對象的相關研究主要以殺菌方式和殺菌效果為主[11]，冷等離子體干預果蔬冷庫微生物群落效果的系統研究還未見報道。

本研究選取了0 ℃果蔬冷庫，采用冷等離子體技術對冷庫環境進行殺菌處理，通過高通量測序，鑒定了冷等離子體處理前后冷庫環境空氣中細菌群落和真菌群落的主要組成及結構變化，并構建了微生物共生網絡，為提高冷庫整體保鮮技術水平提供思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

營養瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）北京奧博星生物技術有限公司；0.22 μm微孔濾膜生工生物工程（上海）股份有限公司；無菌拭子 比克曼生物科技有限公司；DNA提取試劑盒（PowerSoil DNA Isolation Kit） 美國MoBio Laboratories；Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒 美國Beckman Coulter公司。

SPX-250B-Z型生化培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；DW-HL398型超低溫冷凍儲存箱 中科美菱低溫科技股份有限公司；TD1198-03型便攜式臭氧氣體檢測報警儀 北京天地首和科技發展有限公司；NanoDrop 2000型分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific；DYY-7C型電泳儀 北京市六一儀器廠；MiSeq PE300高通量測序平臺美國Illumina公司；WTR-33型等離子保鮮設備 購于唐山衡生空氣凈化器設備有限公司，該設備尺寸為：446 mm×116 mm×320 mm，內含介質阻擋放電等離子體發生裝置和氣體循環風扇，額定功率為150 W，額定臭氧產生速率為2.50 g/h，可設1%～99%濃度，工作時間可設1～60 min，按小時循環工作。

1.2 實驗方法

1.2.1 冷等離子體處理 將WTR-33等離子保鮮設備懸掛于3 m×2 m×2 m的0 ℃果蔬冷庫中，高度為1.60 m。設置臭氧發生濃度為10%，工作時間為每小時10 min。設備開始工作后，設置5個高度與采樣點一致、按梅花布點的測量點，使用臭氧檢測儀檢測冷庫中臭氧濃度，繪制臭氧濃度隨時間變化的曲線圖。

1.2.2 微生物濃度檢測 WTR-33等離子保鮮設備循環工作前及工作30 d后，采用自然沉降法[16]對果蔬冷庫中的微生物進行采樣，設置5個采樣點，每個點4塊平板，包括2塊真菌培養基和2塊細菌培養基。真菌培養基為沙氏培養基，細菌培養基為營養瓊脂培養基。取樣時將培養基平板打開靜置10 min，使空氣微生物小顆粒沉降到培養基表面。采樣完成后，蓋上蓋子，將培養皿倒置于恒溫培養箱中培養，細菌于37 ℃下培養48 h；真菌于28 ℃下培養72 h。培養結束后，對培養皿進行菌落計數，根據奧氏公式計算空氣微生物濃度（CFU/m3）。

菌落計數后，按照如下公式計算出受檢環境空氣中的微生物濃度[17]：

式中：C—空氣中微生物濃度（CFU/m3）；A—平板面積（cm2）；N—培養皿菌落數（個）；t—暴露時間（min）。

1.2.3 微生物樣品采集 采集等離子體處理前及處理30 d后冷庫空氣環境中的微生物。取樣容器為直徑5 cm的0.22 μm有機系微孔濾膜，抽濾1 h，收集空氣微顆粒，將吸附微顆粒的過濾膜裝入無菌鋁箔內，密封在-80 ℃儲存。冷等離子體處理前和處理30 d后的冷庫空氣微生物樣品分別編號為ES0和ES1。

1.2.4 基因組DNA提取和PCR擴增 使用MO BIO PowerSoil?DNA Isolation Kit對樣品基因組DNA進行提取，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，利用NanoDrop 2000分光光度計檢測DNA的濃度和純度。

細菌的16S rDNA 擴增引物為V3+V4 區通用引 物338F（5‘-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3‘）和806R（5‘-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3‘），真菌擴增引物為ITS1F（5‘-CTTGGTCATTTAGAGGA AGTA-3‘）和ITS2R（5‘-GCTGCGTTCTTCATCGATG C-3‘）[18]。

PCR擴增體系25 μL：DNA樣品30 ng，2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 3 μL，5 μmol/L Forward Primer 1 μL，5 μmol/L Reverse Primer 1 μL，加ddH2O至25 μL。細菌PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min，30次循環（94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s），最后72 ℃延伸7 min。真菌PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min，34次循環（94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s），最后72 ℃延伸7 min。

PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用Agencourt AMPure XP核酸純化試劑盒純化，構建文庫，利用Illumina MiSeq PE300平臺進行測序。

1.3 數據統計與分析

原始數據下機后，結果以Fastq格式存儲。利用Trimmomatic （Version 0.36）、Pear （Version 0.9.6）對Fastq數據進行質控。利用Flash （Version 1.20）、Pear根據PE的overlap關系對兩端序列進行拼接（merge）處理，得到Fasta序列。根據已知數據庫用UCHIME方法比對去除Fasta序列的嵌合體，對于未知數據庫使用自比對（denovo）方法進行去除，同時去除不合要求的短序列。下機數據（Raw PE），在去除barcode和primer并拼接后得到raw tags，raw tags經進一步去除嵌合體、短序列后得到優質序列clean tags。用Qiime軟件（Version 1.8.0 http://qiime.org/）計算相關指數，使用R軟件（Version 2.15.3）繪制物種多樣性曲線。使用VSEARCH （Version 2.7.1 https://github.com/torognes/vsearch） 對有效數據進行97%的相似度聚類[19]，采用UPARSE聚類法將序列相似性大于97%的clean tags定為一個OTU（operational taxonomy unit）[20]。基于OTU聚類分析結果及代表序列，進一步進行多樣性分析和差異分析等。分析數據庫包括：SILVA （Release 128 http://www.arb-silva.de）、UNITE （Release 8.2 http://unite.ut.ee/index.php） 的真菌數據庫、NCBI Nucleotide（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 數據庫和BLAST（2.6.0+ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）。本研究使用R語言工具及其igraph包，psych包，選取所有樣本絕對豐度前20的屬水平結果進行相互關聯性分析，并以對應的門作為legend，過濾掉P值大于0.05的或相關值|R|＜0.6的結果，使用Cytoscape 3.80進行繪圖。

所有處理組至少含有4次生物學重復。用Microsoft Office Excel 2019對數據進行統計并算標準誤差。數據結果以平均值±標準偏差（standard deviation, SD）表示。用OriginPro 2018作圖。用IBM SPSS Statistics 25.0軟件對數據進行方差分析（ANOVA），采用配對T檢驗（Student‘s T test）和Turkey test進行顯著性分析，P＜0.05時代表差異顯著，P＜0.01時代表差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 冷等離子體處理時果蔬冷庫中臭氧濃度變化

臭氧是冷等離子體中的主要活性氧成分，其可以誘導氧化損傷從而發揮抗菌作用[21]。由圖1可知，等離子體設備按小時循環工作時，冷庫中臭氧濃度先急劇上升至10 μL/L后緩慢下降，周期循環波動。

圖1 果蔬冷庫中臭氧濃度變化曲線Fig.1 Changes of ozone concentration in cold storage over time

2.2 冷等離子體處理對果蔬冷庫微生物數量的影響

冷等離子體處理前后冷庫空氣中微生物數量變化如圖2所示。冷等離子體處理后細菌濃度由137 CFU/m3降低到了11 CFU/m3，真菌濃度由343 CFU/m3降低到了33 CFU/m3，表明冷等離子體對冷庫空氣中的微生物具有良好的殺滅效果。真菌對于等離子體的抗性高于細菌，可能是因其細胞壁厚度、成分等不同[22]。

圖2 冷等離子體處理前后果蔬冷庫微生物數量變化Fig.2 Microorganism concentration in cold storage before and after cold plasma treatment

2.3 冷等離子體處理對果蔬冷庫微生物多樣性的影響

所有樣品的覆蓋率（Coverage）均達到0.9999（表1），說明樣品中有未被測出的序列的概率較低，測序數量已飽和，能夠真正反映冷庫空氣中微生物菌群結構及組成多樣性的情況。

表1 果蔬冷庫空氣樣品高通量測序質量Table 1 Quality of high-throughput sequencing of air samples in cold storage

細菌和真菌群落的α-多樣性指數箱線圖分別如圖3 和圖4所示。PD whole tree表示譜系多樣性，是兼顧考慮了物種豐度以及進化距離的多樣性指數，是基于系統發育樹來計算的一種多樣性指數，其數值越大，表示群落多樣性越高[23]。Chao 1是物種豐富度指數，對稀有物種敏感，代表物種種類數目的豐富度[24]。Shannon指數和Simpson指數與物種豐富度和均勻度呈正相關，Shannon指數對物種豐富度更敏感，Simpson指數對物種均勻度更敏感[25]。

冷等離子體處理后，果蔬冷庫空氣中細菌群落的PD whole tree指數、Chao 1指數和Shannon指數均顯著降低（P＜0.05），Simpson指數有所降低但差異不顯著（P＞0.05）（圖3）；真菌群落的PD whole tree指數和Chao 1指數變化不明顯，但是Shannon指數和Simpson指數極顯著降低（P＜0.001）（圖4）。總體而言，冷等離子體處理顯著降低了果蔬冷庫空氣中微生物的α多樣性，且處理前后，真菌的多樣性均高于細菌，說明真菌群落結構更復雜。

圖3 細菌群落α多樣性指數箱線圖Fig.3 Boxplot of α diversity index of bacterial community

圖4 真菌群落α多樣性指數箱線圖Fig.4 Boxplot of α diversity index of fungal community

為了進一步分析冷等離子體處理前后果蔬冷庫空氣中微生物群落組成的差異性，基于OTU圖譜，采用加權UniFrac矩陣法計算細菌群落和真菌群落的β-多樣性，進行基于Bray-Curtis距離的主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和多元方差分析（permutational multivariate analysis of variance，PERMANOVA）。PCoA分析可以直觀顯示不同樣品中微生物群落結構上的相似性及差異性，不同樣品間的距離越小，則兩個樣品之間的微生物群落結構差異性越小[26]。如圖5所示，PC1（48.05%，57.28%）能夠很好的區分冷等離子體處理前后的樣品，處理前后的樣品點之間距離有明顯分離。與處理前相比，冷等離子體處理后冷庫空氣中的細菌群落結構和真菌群落結構都發生了顯著的變化，結合α多樣性分析的結果，表明冷等離子體處理能夠顯著降低冷庫空氣中的微生物多樣性。

圖5 基于Bray-Curtis距離的細菌（a）和真菌（b）群落主坐標分析（PCoA）圖Fig.5 Principal coordinate analysis （PCoA） plots based on the Bray-Curtis distance for bacterial （a） and fungal （b）communities in samples

2.4 冷等離子體處理對果蔬冷庫環境中微生物群落組成的影響

為明確冷等離子體處理前后的果蔬冷庫空氣環境中的主要微生物組成，根據物種注釋結果，選取每個樣本或分組中在門和屬水平上相對豐度大于1%的物種，生成了物種相對豐度柱形累加圖（圖6和圖7）。

圖6 冷等離子體處理前后冷庫環境中細菌門水平（a）和屬水平（b）的群落組成Fig.6 Bacterial community composition at the level of phylum （a） and genus （b） in cold storage environment before and after cold plasma treatment

圖7 冷等離子體處理前后果蔬冷庫環境中真菌門水平（a）和屬水平（b）的群落組成Fig.7 Fungal community composition at the level of phylum （a） and genus （b） in cold storage environment before and after cold plasma treatment

如圖6所示，在門水平上，冷等離子體處理前后，細菌群落組成中均主要是厚壁菌門（Firmicutes）（83.87%，88.36%）占絕對優勢，其次是變形菌門（Proteobacteria）（9.32%，8.78%）。冷等離子體處理后，藍細菌門（Cyanobacteria）相對豐度由處理前的3.02%降為0。厚壁菌門屬于革蘭氏陽性菌[27]，細胞壁由一層較厚（10～50 nm）的含胞壁酸的肽聚糖構成。變形菌門屬于革蘭氏陰性菌[28]，細胞壁中不含磷壁酸，肽聚糖含量低，較疏松。變形菌門是細菌中最大的一門，包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺桿菌等著名的種類。藍細菌門也是一類革蘭氏染色陰性菌，與水環境關系密切，可引起淡水水體水華爆發或水質惡化等環境問題[29]。有研究表明，通常等離子體對革蘭氏陰性菌的滅活效果要優于革蘭氏陽性菌，且細胞壁的厚度與殺滅時間呈正相關[30]。本研究中冷等離子體處理后，變形菌門和藍細菌門相對豐度下降，而厚壁菌門相對豐度隨之有所上升與以上研究結論相符。

在細菌群落屬水平上，冷等離子體處理前后均是厚壁菌門的芽孢桿菌屬（Bacillus）（78.09%，86.43%）占據優勢地位，這與Ye等[5]對冰箱里微生物多樣性的研究結果一致，該研究發現不同冰箱里芽孢桿菌屬（Bacillus）均為主要優勢菌屬，相對豐度最高可達85.80%；其次是變形菌門的從毛單孢菌屬（Comamonas）（2.22%，2.10%）。冷等離子體處理后，未確定菌屬的細菌（unidentified）相對豐度由處理前的4.09%降為0.22%，變形菌門的醋酸桿菌屬（Acetobacter）和未培養細菌（uncultured bacterium）分別由處理前的1.42%和1.27%降為0，變形菌門的Acidibacter和不動桿菌屬（Acinetobacter）均有所升高，分別由處理前的0.77%和0.54%變為1.94%和1.16%。以上結果表明等離子體對冷庫空氣中的芽孢桿菌屬細菌作用不明顯，而對醋酸桿菌屬和未培養細菌有明顯的滅活作用。Acidibacter和不動桿菌屬的升高可能是因為其他菌屬的豐度降低而導致其相對豐度相應升高。醋酸桿菌屬是一類有較強氧化能力、可使果蔬腐敗變質的革蘭氏陽性細菌[31]，未培養細菌大都是革蘭氏陰性的致病菌[29]，冷等離子體處理可使這兩類細菌相對豐度顯著下降，表明其在果蔬采后貯藏保鮮中有良好的應用潛力。

如圖7所示，在門水平上，冷等離子體處理前，真菌群落組成中占據優勢的是子囊菌門（Ascomycota）（84.50%）和擔子菌門（Basidiomycota）（25.59%）。擔子菌門真菌種類繁多，可食用與藥用的較多，部分可引起植物病害與木材腐爛[32]。子囊菌門真菌可營腐生、寄生和共生，腐生的子囊菌可引起食品腐爛霉變，寄生的子囊菌常引起植物病害[33]。冷等離子體處理后，子囊菌門相對豐度下降為7.46%，擔子菌門隨之成為主要優勢菌門（67.61%）。其中，處理前后未確認分類的真菌均相對較多（unidentified）（5.48%，6.68%）。

在真菌群落屬水平上，冷等離子體處理前占據優勢地位的是未確定菌屬的真菌（unidentified）（32.82%）、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）（9.11%）、曲霉屬（Aspergillus）（6.45%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）（6.43%）和Rasamsonia（4.16%）等。冷等離子體處理后，其他優勢菌屬相對豐度下降，而未確定菌屬的真菌仍占據優勢地位，且相對豐度隨之變為89.80%。表明在真菌群落方面，對冷等離子體敏感的菌屬較多。擔子菌門的威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、紅菇屬（Russula）和小皮傘屬（Marasmius）在冷等離子體的作用下相對豐度降為0。子囊菌門的復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、曲霉屬（Aspergillus）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、Rasamsonia、青霉菌屬（Penicillium）和螺旋聚孢霉屬（Clonostachys）也在冷等離子體的作用下大幅度降低。相對豐度變化較大的復膜孢酵母屬、曲霉屬和嗜熱子囊菌屬真菌多用于現代發酵工業[34]，于果蔬貯藏保鮮有害無益；Rasamsonia是可引起人類侵染性感染、威脅生命的真菌[35]；青霉菌屬可引起果蔬腐爛霉變及產生毒素[36]。這些真菌屬相對豐度的顯著降低，表明冷等離子體處理可以一定程度上殺滅冷庫環境中植物病原菌及人類致病菌。

2.5 微生物共生網絡構建

通過spearman檢驗方法[37]，分別選取細菌和真菌所有樣本絕對豐度前20的屬水平結果進行相互關聯性分析，并以對應的門作為legend，計算所得結果過濾掉P值大于0.05的或相關值|R|＜0.6的進行繪圖，分別構建了細菌與真菌的共生網絡（圖8）。不同顏色的節點代表不同的所屬門，節點大小代表分類學豐度，紅線代表正相關，線的粗細代表相關性的強度，線粗表示相關性較強。

圖8 果蔬冷庫環境中細菌（a）和真菌（b）共生網絡Fig.8 Co-occurrence network of bacteria （a） and fungi （b） in cold storage environment

如圖8所示，細菌屬共生網絡圖包含12個節點和11條邊，真菌屬共生網絡圖包含10個節點和12條邊。可以發現，果蔬冷庫微生物之間存在較為緊密的聯系，并且都是正相關關系，說明不同的類群之間可能生態位較為相似或彼此之間存在互利共生的關系[38]。細菌屬共生網絡中連通度較高的主要類群為厚壁菌門和擬桿菌門。水棲菌屬（Enhydrobacter）僅與普氏厭氧球菌屬（Anaerococcus_provencensis）存在強烈的正相關關系（P＜0.01），與之類似的還有葡萄球菌屬（Staphylococcus）和擬桿菌屬（Bacteroides）。Sedimentibacter不僅與Proteiniborus和未培養細菌（uncultured bacterium）存在強烈的正相關關系，還與醋酸桿菌屬（Acetobacter）和Candidatus_Actinomarina存在較強的正相關關系，表明其對果蔬冷庫細菌群落結構起著重要作用，且物種間多存在著互利共生關系。真菌屬共生網絡中只包含兩個門類群，其中子囊菌門連通度較高。由真菌屬共生網絡的節點大小可以明顯發現果蔬冷庫中真菌類群的豐度顯著高于細菌類群。螺旋聚孢霉（Clonostachys）和毛殼菌屬（Chaetomium）分別僅與紅菇屬（Russula）和Sampaiozyma存在正相關關系（P＜0.01）。復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、Rasamsonia和威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）相互之間存在強烈的正相關關系（P＜0.01），且連通度均較高，表明這4個菌屬呈共生關系，在果蔬冷庫真菌群落結構中起著關鍵作用。

3 結論

通過對冷等離子體處理前后的0 ℃果蔬冷庫空氣中微生物數量及微生物群落多樣性的研究，發現冷等離子體處理后，冷庫空氣中細菌、真菌數量與群落多樣性均顯著降低，說明冷等離子體可以應用于果蔬冷庫中殺菌消毒，但其對冷庫中貯藏期果蔬的影響還有待系統研究。處理前后，真菌群落多樣性均高于細菌群落多樣性，可能是冷庫環境更適合真菌生長或真菌菌群的競爭優勢大于細菌菌群。門水平上，冷庫空氣中的優勢細菌為厚壁菌門，優勢真菌為子囊菌門（處理前）和擔子菌門（處理后）。屬水平上，芽孢桿菌屬細菌和未確定菌屬的真菌始終占據優勢地位。群落組成結構的研究表明，冷等離子體處理可有效殺滅醋酸桿菌屬和未培養細菌等細菌，復膜孢酵母屬、曲霉屬、嗜熱子囊菌屬、Rasamsonia和青霉菌屬等真菌，為后續開發冷等離子體廣譜抑菌新技術提供了理論基礎。網絡分析表明，細菌中Sedimentibacter與其他物種存在強烈的相關性，真菌中復膜孢酵母屬、嗜熱子囊菌屬、Rasamsonia和威克漢姆酵母屬相互之間存在強烈的相關性，且均為正相關關系。冷庫中微生物群落之間的協同關系可能對抑菌劑開發時的應用范圍研究有一定的啟發。本研究中存在很多未能確定分類的菌屬，在微生物分類學意義上還有待深入研究。