沙棘添加對(duì)乳酸菌發(fā)酵牛乳風(fēng)味和消費(fèi)者接受度的影響

葛曉佳，唐楠煜，楊 瑞，趙小淦，劉再美，許丹玲，劉玉肖，李 偉

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院， 江蘇南京 210095）

沙棘（拉丁學(xué)名：Hippophae rhamnoidesLinn.）是一種胡頹子科、沙棘屬落葉性灌木，成熟的沙棘果實(shí)呈橢圓形或圓形，根據(jù)品種的不同有黃色、橙色或紅色之分[1-2]，具有獨(dú)特的風(fēng)味和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，被譽(yù)為“綠色黃金”[3]。我國(guó)是全球沙棘資源最豐富的國(guó)家，天然生長(zhǎng)的沙棘多達(dá)4個(gè)種5個(gè)亞種，分布在我國(guó)的西北、華北和西南等地區(qū)[4]。芬蘭沙棘分類(lèi)學(xué)家羅西教授將沙棘分為4個(gè)種9個(gè)亞種，而根據(jù)我國(guó)沙棘分類(lèi)學(xué)家廉永善教授的分類(lèi)法，沙棘一共可以分為6個(gè)種12個(gè)亞種[5]。目前市面上有200多種沙棘的衍生產(chǎn)品，包括各種保健食品、化妝品和藥品。各國(guó)研究者對(duì)沙棘在醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用研究的興趣日益濃厚[6]。從沙棘中提取的制劑已被臨床應(yīng)用于治療輻射損傷、燒傷、軟組織潰瘍和心腦血管疾病等案例，在我國(guó)藏藥中也有悠久的應(yīng)用歷史[7-8]。

根據(jù)FinDiet的調(diào)查，沙棘作為日常飲食的一部分可以預(yù)防慢性疾病及不良生活習(xí)慣引起的其他疾病[9]，但由于大量有機(jī)酸（≈5.4%）和酚酸的存在，沙棘漿果味道酸澀，消費(fèi)者接受度低。目前沙棘已經(jīng)衍生出各種消費(fèi)者可以接受的食品如風(fēng)味酸奶、果汁、果醋、果醬和果凍，甚至還被應(yīng)用于嬰兒食品中[10-11]。因?yàn)樯臣兄饕挠袡C(jī)酸是酸味強(qiáng)烈而刺激的蘋(píng)果酸，現(xiàn)在也有一些研究利用蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵（MLF，Malolactic fermentation），將蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化為酸味更柔和的乳酸，一定程度上減輕酸澀味[12-14]。將沙棘果汁引入酸奶制成風(fēng)味酸奶是一種較為簡(jiǎn)便易行的可以有效減輕沙棘不良風(fēng)味的方式，在國(guó)內(nèi)外已有一定的研究基礎(chǔ)，但是大多數(shù)研究側(cè)重于新型產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和產(chǎn)品工藝的優(yōu)化，而添加沙棘造成酸奶風(fēng)味和消費(fèi)者接受度變化的系統(tǒng)研究非常少見(jiàn)。傳統(tǒng)研究中發(fā)酵酸奶所用菌株也局限于一般商業(yè)化發(fā)酵劑（即：嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種），使用其他乳酸菌發(fā)酵酸奶的研究比較少。本實(shí)驗(yàn)采用電子鼻、電子舌和感官評(píng)價(jià)結(jié)合HS-SPME-GC/MS的方法，分析了添加沙棘對(duì)發(fā)酵乳氣味、滋味及消費(fèi)者接受度的影響，為沙棘衍生功能性食品的開(kāi)發(fā)提供了思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘原漿 遼寧省朝陽(yáng)市建平縣采購(gòu)的大果沙棘經(jīng)過(guò)初步殺菌處理的產(chǎn)品；伊利全脂純牛奶 江蘇省南京市玄武區(qū)蘇果超市；蛋白胨、酵母浸粉 分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、無(wú)水乙酸鈉、檸檬酸銨、K2HPO4·3H2O 分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司；牛肉膏 分析純，上海博威生物醫(yī)藥有限公司；MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O 、吐溫80 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏8 g、酵母浸粉4 g、葡萄糖20 g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸銨2 g、無(wú)水乙酸鈉5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、吐溫80 1 g 溶于1 L蒸餾水，121 °C滅菌20 min。

本實(shí)驗(yàn)中所用菌株均為本實(shí)驗(yàn)室自有保藏菌種，詳細(xì)信息見(jiàn)表1，以下敘述中分別用編號(hào)Z-3代表“Lactobacillus pentosusZ-3”，Z-14代表“L.pentosusZ-14”，以此類(lèi)推。

表1 8株乳酸菌來(lái)源及微生物學(xué)分類(lèi)Table 1 Source and microbiological classification of eight LAB strains

LDZX-40AI型立式電熱壓力滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱上海博遠(yuǎn)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；AIR TECH潔凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司制造；LRH-150系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Beckman Avanti J-E冷凍離心機(jī) 美國(guó)BECKEMAN公司；島津AUY-120分析天平 日本SHIMADZU公司；SL-N ELECTRONIC BALANCE電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限司；加熱磁力攪拌器 常州市金壇大地自動(dòng)化儀器廠；PEN2型電子鼻 德國(guó)Airsense公司；SA402B型電子舌 日本INSENT公司；320-MS GC/MS氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)布魯克道爾頓質(zhì)譜公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS型號(hào)固相微萃取頭 美國(guó)Supelco科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌活化 按照2%（v/v）的接種量，將-80 ℃甘油管中保藏的菌株接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h，然后按照相同的條件連續(xù)傳代培養(yǎng)3次。保留三活菌液（OD600達(dá)到1.4～1.6）用于發(fā)酵乳的制備。

1.2.2 發(fā)酵乳制備 在滅菌錐形瓶中接入50 mL含有不同濃度（0%、2.5%、5.0%、7.5%，v/v）沙棘原漿的全脂純牛奶，混合均勻，65 ℃巴氏殺菌30 min，以6%（v/v）的接種量接種三活菌液，37 ℃發(fā)酵直至凝乳，觀察并記錄發(fā)酵乳凝乳所需時(shí)間。將得到的發(fā)酵乳樣品保存在4 ℃冰箱等待下一步分析。

1.2.3 電子鼻檢測(cè) 參考李婷、楊爽等[15-16]報(bào)道的方法對(duì)樣品進(jìn)行電子鼻檢測(cè)，略有改動(dòng)。取4 g發(fā)酵乳于20 mL頂空瓶中并封口，42 ℃水浴平衡30 min。用電子鼻進(jìn)行氣味錄入，數(shù)據(jù)采集時(shí)間90 s，載氣為干燥潔凈的空氣，內(nèi)部流量400 mL/min，進(jìn)樣流量400 mL/min，樣品準(zhǔn)備時(shí)間5 s，傳感器清洗時(shí)間180 s，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。實(shí)驗(yàn)所使用電子鼻各氣敏傳感器陣列及特征描述見(jiàn)表2。

表2 電子鼻10種氣敏傳感器陣列及其特征描述Table 2 Ten types and characteristics of gas sensor arrays based on PEN 2 electronic nose

1.2.4 電子舌檢測(cè) SA402B型電子舌主要配備5種傳感器，分別是咸味（CTO），鮮味（AAE），酸味（CAO），苦味（COO）和澀味（AEI）。發(fā)酵乳加入同等體積去離子水稀釋?zhuān)?0000 r/min室溫離心10 min，取40 mL上清液于測(cè)量杯中，設(shè)置采樣時(shí)間120 s，每種樣品平行測(cè)定4次。

1.2.5 發(fā)酵乳感官評(píng)定 參考楊璐、劉俊艷和李超敏等[17-19]的研究方法，選取10位經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)的感官評(píng)價(jià)員，通過(guò)色澤、香氣、滋味及質(zhì)構(gòu)四個(gè)因素分別對(duì)樣品進(jìn)行打分。感官評(píng)價(jià)人員在評(píng)價(jià)前應(yīng)避免接觸刺激性強(qiáng)的物品或嚼口香糖，抹去唇膏，避免濃妝和噴香水，不能使用有氣味的化妝品或肥皂，每評(píng)定完一個(gè)樣品后以清水漱口。評(píng)定結(jié)束后收集評(píng)價(jià)表，并以模糊數(shù)學(xué)法構(gòu)建綜合評(píng)判模型分析得分?jǐn)?shù)據(jù)，詳細(xì)的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表3和表4。

表3 沙棘發(fā)酵乳的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation criterion of sea buckthorn yoghurt

表4 原味發(fā)酵乳的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 4 Sensory evaluation criterion of plain yoghurt

按照感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定因素集U={u1, u2, u3,u4}={色澤，香氣，滋味，質(zhì)構(gòu)}，評(píng)語(yǔ)集V={v1, v2, v3}={好，較好，差}。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)確定權(quán)重集X={x1,x2, x3, x4}={0.15, 0.35, 0.30, 0.20}，總和為1。由此創(chuàng)建模糊關(guān)系綜合評(píng)判集Y=X×R，其中X為權(quán)重集，R為模糊數(shù)學(xué)評(píng)判矩陣。

1.2.6 HS-SPME-GC/MS檢測(cè) 參考成堃、SOCACI和TIITINEN等[20-22]報(bào)道的方法，采用HS-SPME法收集揮發(fā)性成分，結(jié)合GC/MS對(duì)樣品中風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，略有改動(dòng)。

1.2.6.1 樣品前處理 稱(chēng)取5 g待檢樣品于20 mL裝有磁力攪拌子的頂空采樣瓶中，密封并在45 ℃水浴平衡30 min，開(kāi)啟磁力攪拌器，設(shè)置溫度45 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min。然后將手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣器固定在搭載裝置上，將針頭插入頂空瓶中，推出萃取纖維，頂空吸附萃取60 min。吸附結(jié)束后將萃取頭插入進(jìn)樣口，250 ℃解析3 min。

1.2.6.2 GC條件 進(jìn)樣器溫度260 ℃，檢測(cè)器溫度270 ℃，載氣He，流速1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣；初始柱溫35 ℃，保持12 min，以10 ℃/min的速度升溫至105 ℃，1 ℃/min升至135 ℃，20 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

1.2.6.3 MS條件 電離方式為EI源，電離能70 eV，離子源溫度220 ℃，檢測(cè)電壓1.8 kV，質(zhì)量掃描范圍m/z 33～450 amu，發(fā)射電流100 μA。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，作圖采用Origin軟件2021版本。GC/MS的結(jié)果圖譜用儀器自帶的軟件進(jìn)行分析，然后導(dǎo)出并使用Excel 2016進(jìn)行匯總。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘添加量的確定

如表5所示，不添加沙棘的發(fā)酵乳凝乳時(shí)間均高于9 h，甚至有超過(guò)50%的乳酸菌沒(méi)有在12 h內(nèi)完成凝乳，而添加5%（v/v）沙棘后乳酸菌的凝乳時(shí)間最短，可以達(dá)到4～5 h，已接近商業(yè)發(fā)酵劑的效率。由此可以看出，添加5%沙棘可以明顯縮短凝乳所需時(shí)間。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生一方面可能是由于沙棘的添加降低了乳基的pH，為乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖提供了適宜的環(huán)境，另一方面可能是由于沙棘中富含的低聚果糖起到了益生元的作用[23]，促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)，還有研究顯示蛋白質(zhì)和沙棘中富含的酚類(lèi)物質(zhì)相互作用會(huì)對(duì)發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生影響[24-26]。

表5 不同乳酸菌發(fā)酵不同濃度的沙棘發(fā)酵乳的凝乳時(shí)間Table 5 The coagulation time of yogurt with different concentrations of sea buckthorn and fermented by different LAB strains

故在本實(shí)驗(yàn)中，選取添加5%沙棘的發(fā)酵乳（沙棘發(fā)酵乳）為實(shí)驗(yàn)組、不添加沙棘的發(fā)酵乳（原味發(fā)酵乳）為對(duì)照組進(jìn)行風(fēng)味對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

2.2 電子鼻分析沙棘對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的影響

電子鼻是用于檢測(cè)、識(shí)別和分析某些復(fù)雜氣味的儀器，基于仿生學(xué)原理所以跟一般化學(xué)分析儀器不同，得到的不是某些確定成分的定性定量分析數(shù)據(jù)，而是某一類(lèi)揮發(fā)性成分的整體信息，也就是常說(shuō)的“指紋”信息[27]。圖1為不同樣品電子鼻分析結(jié)果，可以看到，添加沙棘的樣品和不添加沙棘的樣品在各個(gè)探頭的響應(yīng)值呈現(xiàn)較大的差異，這說(shuō)明添加沙棘可以對(duì)發(fā)酵乳的氣味產(chǎn)生顯著的影響。如圖1A所示，添加沙棘后的樣品顯示W(wǎng)1W和W2W的響應(yīng)值上升，這表明添加沙棘可以增加香氣成分，如萜烯、芳香性物質(zhì)或含硫化合物[28]。W1S對(duì)烷烴等有害物質(zhì)敏感，在未經(jīng)過(guò)發(fā)酵的樣品，即M5中，W1S探頭的響應(yīng)值為1.20，而經(jīng)過(guò)不同乳酸菌發(fā)酵之后，該探頭的響應(yīng)值有不同程度的降低，最低可以達(dá)到1.06，這表明乳酸菌發(fā)酵可以在一定程度上減弱沙棘中的不良?xì)馕丁1C、W3C和W5C分別對(duì)芳香性成分、氨水和烷烴類(lèi)物質(zhì)靈敏度大，添加沙棘后的樣品經(jīng)W1C、W3C和W5C傳感器檢測(cè)到的信號(hào)均有不同程度的降低，經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后，響應(yīng)值進(jìn)一步降低，說(shuō)明乳酸菌可以代謝掉一些產(chǎn)生不良?xì)馕兜某煞帧?/p>

2.3 電子舌對(duì)發(fā)酵乳中的風(fēng)味物質(zhì)分析

電子舌利用5個(gè)味覺(jué)傳感器和2個(gè)參比電極，實(shí)現(xiàn)對(duì)人體5種味覺(jué)（酸、苦、咸、鮮、澀）以及相關(guān)后味的分析。圖2為不同樣品的電子舌分析結(jié)果。如圖2A所示，添加沙棘可以增強(qiáng)樣品的酸味和澀味，降低鮮味，酸澀味的產(chǎn)生是由于沙棘中存在大量的有機(jī)酸和酚類(lèi)物質(zhì)，強(qiáng)烈的酸味會(huì)掩蓋一部分牛奶的鮮味。而經(jīng)過(guò)SNA、SNB、S-A、Z-15、L17和Z-3的發(fā)酵，沙棘發(fā)酵乳的酸味低于原味發(fā)酵乳的酸味，可能是沙棘中呈現(xiàn)刺激性酸味的有機(jī)酸被乳酸菌轉(zhuǎn)化為更加柔和的乳酸。沙棘發(fā)酵乳的鮮味隨著不同乳酸菌的作用逐漸高于原味發(fā)酵乳，可能是乳酸菌代

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵的沙棘發(fā)酵乳和原味發(fā)酵乳的電子舌分析Fig.2 Radar plots of sea buckthorn yogurt and plain yogurt fermented by different lactic acid bacteria obtained by E-tongue

一個(gè)綜合評(píng)價(jià)等級(jí)為“好”的樣品，具有最高的消費(fèi)者接受度。綜合所有樣品的綜合評(píng)定分?jǐn)?shù)選出SNB、S-A和Z-14進(jìn)行GC-MS分析。

表7 模糊數(shù)學(xué)綜合評(píng)判結(jié)果Table 7 Comprehensive evaluation results of fuzzy mathematics

2.5 發(fā)酵乳揮發(fā)性成分HS-SPME-GC/MS分析

表8列出了部分從沙棘發(fā)酵乳和原味發(fā)酵乳中測(cè)得的香氣成分，其中包括酯類(lèi)19種，酮類(lèi)4種，有機(jī)酸4種，烷類(lèi)2種，醇類(lèi)3種。圖3為實(shí)驗(yàn)中6種發(fā)酵乳揮發(fā)性風(fēng)味成分總離子流色譜圖。如表8所示，幾乎所有的酯類(lèi)化合物都是由沙棘帶來(lái)的，在原味發(fā)酵乳中未檢測(cè)到，酯類(lèi)化合物是水果香氣的主要貢獻(xiàn)者。酮類(lèi)化合物呈現(xiàn)比較濃郁的花香以及木質(zhì)香，還有一定的草本香氣，在沙棘發(fā)酵乳和原味發(fā)酵乳中都有檢測(cè)到，整體看來(lái)，原味發(fā)酵乳中含有更豐富、更高含量的酮類(lèi)物質(zhì)。有機(jī)酸可以散發(fā)出強(qiáng)烈的酸味，少量有機(jī)酸的存在可以為食物帶來(lái)愉快的酸爽氣味，但是過(guò)量有機(jī)酸則會(huì)引起食物酸敗氣味產(chǎn)生，影響食欲。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沙棘發(fā)酵乳中含有比原味發(fā)酵乳中含量更低的有機(jī)酸，尤其是SNB發(fā)酵的沙棘發(fā)酵乳，其中檢測(cè)到的辛酸含量相比原味發(fā)酵乳降低了12.37%。發(fā)酵乳中有機(jī)酸含量上升可能是由于樣品前處理中長(zhǎng)時(shí)間的高溫水浴，導(dǎo)致發(fā)酵乳酸敗，從結(jié)果推測(cè)，添加沙棘可以在一定程度上穩(wěn)定發(fā)酵乳品質(zhì)，延緩發(fā)酵乳變質(zhì)。醇類(lèi)物質(zhì)主要在沙棘發(fā)酵乳中檢出，表現(xiàn)為濃郁的發(fā)酵香氣，還有一定的辛辣氣味，這可能是乳酸菌發(fā)酵沙棘產(chǎn)生的。總體上，添加5%沙棘可以增添發(fā)酵乳的香氣，減弱發(fā)酵乳的不良?xì)馕叮瑯拥慕Y(jié)果在電子鼻分析中也可以觀察到。TIITINEN等[22]發(fā)現(xiàn)沙棘中含量最高的化合物是短鏈正構(gòu)或支鏈醇和酸的酯。XU等[29]在研究報(bào)告中指出，發(fā)酵食品中呈現(xiàn)的花香、果味可能與醇、酮和萜烯的含量有關(guān)，和本文觀察的結(jié)果一致。MA等[30]的研究報(bào)告指出，丁酸-3-甲基-2-甲基丁酯被證明跟發(fā)酵后的氣味有關(guān)，辛酸乙酯則呈現(xiàn)一種椰子的香氣。

圖3 GC/MS分析6種樣品揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram for the analysis of volatile component in 6 samples by GC/MS

表8 三株乳酸菌發(fā)酵的沙棘發(fā)酵乳和原味發(fā)酵乳中的香氣成分Table 8 The aroma compounds of sea buckthorn yogurt and plain yogurt fermented by 3 different LAB

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用智能感官分析系統(tǒng)E-nose和Etongue對(duì)發(fā)酵乳的氣味和滋味進(jìn)行分析，結(jié)果顯示添加沙棘會(huì)對(duì)發(fā)酵乳氣味產(chǎn)生顯著的影響，主要是香氣的增加和不良?xì)馕兜臏p弱；添加沙棘還會(huì)顯著增強(qiáng)牛乳的酸味和澀味，而經(jīng)過(guò)不同乳酸菌發(fā)酵之后呈現(xiàn)出苦味的減少和鮮味的增加。然后通過(guò)感官評(píng)價(jià)從四個(gè)方面分析沙棘對(duì)發(fā)酵乳消費(fèi)者接受度的影響，結(jié)果表明Z-14發(fā)酵的沙棘發(fā)酵乳是唯一一個(gè)綜合評(píng)價(jià)等級(jí)為“好”的樣品，說(shuō)明其消費(fèi)者接受度最高。GC/MS結(jié)果顯示添加沙棘可以顯著提高發(fā)酵乳中酯類(lèi)和醇類(lèi)化合物的濃度，酯類(lèi)化合物是水果香氣的主要來(lái)源，可以使發(fā)酵乳呈現(xiàn)濃郁果香，而醇類(lèi)則體現(xiàn)為濃郁的發(fā)酵香氣，可以給發(fā)酵乳帶來(lái)獨(dú)特的發(fā)酵風(fēng)味；添加沙棘還可以減少發(fā)酵乳由于酸敗產(chǎn)生的不良?xì)馕丁Ｔ谄渌麍?bào)道中提到的對(duì)沙棘風(fēng)味形成具有關(guān)鍵性作用的萜烯類(lèi)物質(zhì)在本實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有檢出，可能是蛋白質(zhì)對(duì)這類(lèi)物質(zhì)有一定的吸附作用，在本文中不作深入研究，但是對(duì)如何減弱沙棘的不良風(fēng)味有一定的啟示作用。綜上所述，沙棘可以對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味產(chǎn)生顯著影響，在功能性食品的開(kāi)發(fā)方面具有巨大的潛力。