鼠曲草提取物對·OH誘導的肌原纖維蛋白氧化及結構的影響

熊 杰，伯朝英，常海軍，周文斌，朱建飛

（重慶工商大學環境與資源學院，重慶市特色農產品加工儲運工程技術研究中心，重慶400067）

肌原纖維蛋白（Myofibrillar proteins, MPs）是肌肉中含量最高的蛋白，占肌肉總蛋白含量的55%～60%，是形成肌纖維的鹽溶性結構蛋白群，主要包括肌球蛋白、肌動蛋白、原肌球蛋白、肌鈣蛋白等[1]，這類蛋白質不僅參與肌肉收縮、影響肉的嫩度，還決定著肉制品熱誘導凝膠三維網絡的形成，對肉制品的流變學特性、保水性、乳化性、質構、感官等品質起著至關重要的作用[2]。然而肌肉在加工過程中蛋白質極易受到活性氧自由基（ROS）中·OH的攻擊而發生氧化變性，最終導致肉品質量變差。因此，肉蛋白的抗氧化是保障肉品質量的關鍵。然而出于對傳統抗氧化劑化學合成毒性的擔憂，目前，發掘同樣具有抗氧化潛能的天然提取物用于肉蛋白抗氧化，成為肉品行業的研究熱點。

天然提取物中含有豐富的植物多酚，具有抗氧化、抗菌、抗癌、防治心血管疾病且無毒無害、來源廣泛等特性[3]。鼠曲草（Gnaphalium affineD. Don，清明草）作為我國傳統野菜和藥食同源植物，其富含黃酮類化合物（如槲皮素、蘆丁、木犀草素等）與酚類物質（如沒食子酸、綠原酸等），具有優良的抗菌、抗炎和抗氧化等生理功效[4]。現有研究表明，鼠曲草提取物是一種優良的自由基清除劑，具有較強的還原能力與良好的抗氧化效果，可抑制油脂氧化酸敗[5]。但鼠曲草提取物對肉蛋白的影響非常復雜，直接將鼠曲草提取物應用于肉蛋白抗氧化和探究其與肉蛋白相互作用機制的研究甚少。

因此，本實驗采用Fenton氧化體系模擬實際肌肉加工過程中存在的·OH，選用購買的茶多酚（Tea polyphenols，TP）和自提的鼠曲草提取物（Gnaphalium affineextract，GAE）作為植物提取物代表，用于肌肉蛋白抗氧化，以探討·OH誘導的氧化對MPs理化特性的影響、TP/GAE與MPs相互作用對MPs理化特性及構象的影響，并闡明相關機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬背最長肌 重慶市南岸區人人樂超市（4 ℃冷藏）；茶多酚（純度97%） 上海阿拉丁試劑公司；干鼠曲草 四川省廣安市；2,4,6-三硝基苯磺酸水溶液（5%，TNBS） 北京偶合科技有限公司；水溶性維生素E（Trolox）、牛血清蛋白（BSA）、蘆丁（標準品）、L-抗壞血酸、甘氨酸、L-亮氨酸、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）、哌嗪-1,4-二乙磺酸（PIPES）均為分析純，上海阿拉丁試劑公司；5,5-二硫代雙-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、溴酚藍、溴化鉀、2,4-二硝基苯肼（DNPH）、結晶紫、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、ABTS、過氧化氫（H2O2，30%）、三氯化鐵均為分析純，上海阿達瑪斯試劑有限公司。

UV-1900紫外可見分光光度計 上海翱藝儀器有限公司；V2000可見分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；KQ3200DE數控超聲波清洗機昆山市超聲儀器有限公司；TDZ5-WS多管架自動平衡離心機、TDZ4-WS低速臺式離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；TGL-20高速冷凍離心機 四川蜀科儀器有限公司；Ultra-Turrax T25高速均質勻漿機 德國IKA-WERKE；RE-52AA旋轉蒸發儀上海賢德實驗儀器有限公司；日立F-7000熒光分光光度儀 日本日立公司；IRPrestige-21傅立葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；DGG-9076A 電熱恒溫鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；pHS-3C+酸度計 成都世紀方舟科技有限公司；MM12B絞肉機廣東省韶關市大金食品機械廠；LGJ-10冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鼠曲草提取物的制備 參照高浩祥等[5]的提取方法。干鼠曲草經60 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱烘干4 h后粉碎，過100目篩后獲得干鼠曲草粉。取干鼠曲草粉50 g與1000 mL乙醇溶液（70%，v/v）混合，45 ℃下超聲波（300 W）輔助提取80 min，提取液減壓抽濾，濾液經60 ℃真空濃縮至100 mL，濃縮液經冷凍干燥48 h得鼠曲草提取物，所得提取物保存于棕色干燥皿中備用。

1.2.2 肌原纖維蛋白的提取 以豬背最長肌為實驗原材料，參照PARK等[6]描述的方法提取肌原纖維蛋白。取50 g豬肉解凍（4 ℃，4 h），切條剁碎后置于絞肉機中于低檔位運行30s，肉泥使用5倍體積的僵直緩沖液（10 mmol/L磷酸鈉，0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EGTA，pH7.0）稀釋后使用高速均質勻漿機分散1 min。勻漿經冷凍離心（10000 r/min，10 min，4 ℃）后傾去上清液，所得沉淀再次加入5倍體積僵直緩沖液，重復上次步驟共三次。此后所得沉淀加入5倍體積0.1 mol/L NaCl溶液，勻漿后過濾除去殘余結締組織，用0.1 mol/L HCl調pH為7.0后離心（10000 r/min，10 min，4 ℃），所得白色膏狀沉淀即為肌原纖維蛋白。整個提取過程在0～4 ℃條件下進行，所得肌原纖維蛋白膏置于碎冰中保存并于48 h內使用。以BSA作為標準蛋白，采用雙縮脲法測定其蛋白含量[7]，測得肌原纖維蛋白膏蛋白含量為40%左右。

1.2.3 TP/GAE添加及氧化處理 參照曹云剛[8]的樣品處理方法并加以改進。稱取適量MPs蛋白膏，分別加入不同體積的TP/GAE溶液（6 mg/mL，溶解于15 mmol/L PIPES緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH6.25）），攪拌均勻后加入Fenton氧化體系于4 ℃下氧化12 h。最終蛋白濃度為40 mg/mL，氧化體系濃度為（30 μmol/L FeCl3，100 μmol/L抗壞血酸，3 mmol/L H2O2），TP/GAE含量分別為：0（OX），1.2（TP-L/GAE-L），6（TP-M/GAE-M），30（TP-H/GAE-H）mg/g蛋白質。氧化反應通過添加Trolox（1 mmol/L，終濃度）終止。未添加任何物質及氧化劑但含有Trolox的蛋白溶液作為未氧化對照（Blank）。

1.2.4 鼠曲草提取物的主成分含量及自由基清除能力測定

1.2.4.1 總黃酮、總酚含量的測定 參考陳紅梅等[9]的方法測定總黃酮含量。首先制作蘆丁標準曲線，準確稱取蘆丁標品20 mg溶于40%乙醇溶液并定容至50 mL容量瓶中，得到質量濃度為0.4 mg/mL的蘆丁標液。分別吸取0、1、2、3、4、5 mL標液于25 mL容量瓶中，加40%乙醇溶液補至12.5 mL搖勻后依次加入5% NaNO2溶液0.5 mL，搖勻靜置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻靜置6 min，加入4% NaOH溶液5 mL，用40%乙醇溶液定容至刻度搖勻靜置15 min后于510 nm處測定吸光度。以蘆丁標液的質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得到的標準曲線方程：y=11.2125x+0.00767，R2=0.9995。準確稱取100 mg鼠曲草提取物溶于40%乙醇溶液并定容至100 mL，吸取1 mL樣液于25 mL容量瓶按以上操作測定黃酮含量。鼠曲草提取物中總黃酮含量計算公式如下：

式中：m表示標曲上查得的質量濃度，mg·mL-1；V1表示反應體積，mL；V0表示配制的溶液體積，mL；V2表示取樣量，mL；W表示提取物質量，g。

參考SYMONS等[10]的方法測定總酚含量。首先制作沒食子酸標準曲線，配制1 mg/mL沒食子酸標準液100 mL，分別吸取0、1、2、3、4、5 mL標液于100 mL容量瓶并用水定容至刻度。分別取各濃度梯度標液1 mL于刻度試管內，依次加入福林酚試劑5 mL，搖勻靜置5 min，加入20 mg/mL碳酸鈉溶液4 mL，加水定容至刻度，搖勻靜置30 min后于765 nm處測定吸光度。以沒食子酸標液的質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得到的標準曲線方程：y=0.0069x+0.0066，R2=0.9993。準確稱取25 mg鼠曲草提取物溶解于水并定容至25 mL，吸取1 mL樣液于刻度試管按以上操作測定總酚含量。鼠曲草提取物中總酚含量的計算公式與總黃酮計算公式一致。

1.2.4.2 自由基清除能力測定a .OH自由基清除能力[11]。首先使用30%乙醇溶液分別配制1.0 mg/mL的GAE和VC儲備液，并將儲備液稀釋為0.05 mg/mL。分別取0.5 mL結晶紫溶液（0.4 mmol/L）、0.7 mL H2O2溶液（5.0 mmol/L）和0.7 mL FeSO4溶液（10.0 mmol/L）于一系列10 mL比色管中，各管用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH4.0）定容至10 mL，搖勻放置30 min后于580 nm處測吸光度Ab，同時測定不加H2O2吸光度A0。再按上述步驟在加H2O2之前分別加入不同量稀釋儲備液，測得吸光度As。以樣品濃度（mg/mL）為橫坐標，清除率（%）為縱坐標擬合曲線，計算半抑制濃度（IC50）。

b. DPPH自由基清除能力[11]。同時取不同濃度梯度的GAE（0.063、0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL）和VC（0.016、0.031、0.047、0.063、0.125 mg/mL）樣液0.5 mL于10 mL比色管中，加入4.5 mL DPPH溶液（0.04 mg/mL），搖勻放置30 min后測定517 nm下的吸光度A0。以30%乙醇溶液作為對照，其他操作同樣品組，測其吸光度值A。以樣品濃度（mg/mL）為橫坐標，清除率（%）為縱坐標擬合曲線，計算半抑制濃度（IC50）。

c. ABTS自由基清除能力[8]。準確稱取0.0960 g ABTS和0.0116 g過硫酸鉀，無水乙醇溶解并定容于25 mL棕色容量瓶中，搖勻室溫避光反應12 h，形成ABTS+·儲備液。使用前再次使用無水乙醇稀釋，使其在734 nm處吸光度為0.800左右，為ABTS+·工作液。樣品的測定：同時取不同濃度梯度GAE（0.016、0.020、0.031、0.063、0.125 mg/mL）和VC（0.004、0.008、0.012、0.016、0.020 mg/mL）樣液1.0 mL于10 mL比色管中，加入4 mL ABTS+·工作液，混勻避光6 min后于734 nm處測吸光度（A0），以無水乙醇溶液作為對照，其他操作同樣品組，測其吸光度值A。以樣品濃度（mg/mL）為橫坐標，清除率（%）為縱坐標擬合曲線，計算半抑制濃度（IC50）。此處ABTS自由基的清除率計算公式同DPPH自由基。

1.2.5 羰基含量測定 MP的羰基含量采用2,4-二硝基苯肼（DNPH）法進行測定。參照段麗菊等[12]的方法，并略作修改。取搖勻后的樣液2 mL置于20 mL離心管，加入4 mL 10 mmol/L DNPH（用2 mol/L HCl溶解）, 漩渦混勻，37 ℃避光反應1 h，每隔10 min漩渦1次，此后加入5 mL 20% TCA溶液充分漩渦以沉淀蛋白并終止反應，離心（4000 r/min，10 min）。傾去上清液，所得沉淀用10 mL洗色液（乙醇/乙酸乙酯，1:1，v/v）充分洗滌并離心（4000 r/min，10 min），重復三次，以除去未反應的DNPH。三次洗滌后揮干有機溶劑，加入10 mL 6mol/L鹽酸胍溶液（溶解于20 mmol/L NaH2PO4，pH2.3），37 ℃溫育15 min，離心（4000 r/min，10 min）。上清液于370 nm處測定羰基含量，使用6 mol/L鹽酸胍調零。樣品空白中加入4 mL 2 mol/L HCl，其余步驟同上。羰基濃度用摩爾消光系數22.0 mmol/（L·cm）來計算。羰基含量用每毫克蛋白中含有多少nmol的羰基來表示。

式中：ΔA表示反應管吸光度減去對照管吸光度；ε表示摩爾消光系數，22.0 mmol/（L·cm）；d表示比色光徑，cm；C表示蛋白質量濃度，mg·mL-1；V反總表示鹽酸胍體積，mL；V樣表示樣液體積，mL。

1.2.6 總巰基含量測定 MP的總巰基含量參照GUO等[13]的測定方法，使用DTNB試劑進行測定。使用Tris-甘氨酸緩沖液（10.4 g/L Tris，6.9 g/L甘氨酸，1.2 g/L EDTA，pH8.0）配制1% NaCl溶液將40 mg/mL的肌原纖維蛋白分散液稀釋為5 mg/mL。準確吸取蛋白稀釋液0.5 mL，先后加入使用Tris-甘氨酸緩沖液配制的1.5% SDS溶液5 mL及0.5 mL Ellman’s試劑（使用Tris-甘氨酸緩沖液配制的4 mg/mL DTNB溶液），室溫避光反應15 min后于412 nm波長處測其吸光度。以Tris-甘氨酸緩沖液代替蛋白液作為試劑空白。

式中：A412表示吸光度；D表示稀釋倍數；C表示樣品濃度，mg·mL-1。

1.2.7 自由氨基含量測定 MP中的自由氨基含量按照褚千千等[14]的描述進行測定。準確吸取200 μL稀釋后的蛋白樣品（4 mg/mL）置于玻璃試管中，加入2 mL 1% SDS溶液（溶于0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH8.2）和1 mL 0.01% TNBS，振蕩混勻后于50 ℃水浴鍋中避光反應30 min，再加入2 mL 0.1 mol/L Na2SO3終止反應，15 min冷卻至室溫后，測定420 nm 處吸光度值。相同操作下用蒸餾水代替TNBS反應液作為樣品空白。同時分別配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L的L-亮氨酸溶液，并分別按以上測定方法測定各濃度梯度L-亮氨酸溶液的吸光度，以L-亮氨酸濃度（mmol/L）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得到標準曲線方程：y=0.5091x+0.0816，R2=0.9995。樣品自由氨基含量依據所繪標準曲線來確定，計算公式如下：

式中：C表示樣品吸光度對應標曲查得的濃度，mmol/L；c表示樣品蛋白質量濃度，mg·mL-1。

1.2.8 肌原纖維蛋白結構分析

1.2.8.1 二級結構測定 采用傅立葉變換紅外光譜儀分析MPs的二級結構，參考ZHANG等[15]的方法，準確稱量凍干樣品粉末2 mg，溴化鉀200 mg，混合移至瑪瑙研缽研磨至無反光點，使用壓片機壓制成透明薄片，在紅外光譜儀上掃描，掃描范圍為400～4000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為32。使用PeakFit4.12軟件提取蛋白質酰胺I帶1700～1600 cm-1波段圖譜，對其進行基線校正、傅里葉去卷積和二階導數擬合處理，進而根據各指認峰及面積分析蛋白質二級結構變化。

1.2.8.2 內源性色氨酸熒光光譜分析 參考CAO等[16]的測定方法。用15 mmol/L PIPES 緩沖液（含0.6 mol/L NaCl，pH6.25）將樣品稀釋為蛋白濃度0.4 mg/mL，吸取3 mL置于光程為1 cm的石英比色皿中，經283 nm波長激發，記錄下300～450 nm的發射光譜，激發和發射狹縫均為10 nm，電壓設為400 V，掃描速度為240 nm/min。相同條件下記錄溶劑發射光譜，并從樣品發射光譜中扣除以排除干擾。

1.2.8.3 表面疏水性測定 參考熊杰等[17]文中所述的方法并加以改進。用20 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH6.0）將樣品稀釋為蛋白濃度為5 mg/mL的溶液。吸取5 mL于10 mL的塑料離心管中，加入50 μL 1 mg/mL BPB溶液渦旋混勻，離心（4000 r/min，10 min）。轉移上清液于另一套干凈的離心管，再次離心后于595 nm處測定吸光度值（A）。作為對照（A0），以磷酸鹽緩沖液取代樣品溶液，其他操作相同。以蛋白綁定結合的BPB含量作為疏水性指標：

1.2.9 溶解度測定 參照周揚等[18]的方法，并略作修改。將40 mg/mL的MPs蛋白液稀釋10倍后經冷凍離心（4 ℃，10000 r/min，15 min），測上清液的蛋白質量濃度，上清液和原液中蛋白質量濃度均采用雙縮脲試劑法。蛋白溶解度計算公式如下：

1.3 數據處理

每組數據設計三次重復，利用軟件Origin8.0整理數據并作圖分析，所有數據的顯著性差異由軟件SPSS 19.0進行ANOVA分析所得，差異顯著水平P為0.05。

2 結果與分析

2.1 鼠曲草提取物的主成分含量及其清除自由基的能力

蛋白質氧化機制與脂肪氧化機制類似，都是自由基鏈式反應，尤其是活性氧所攜帶的·OH氧化能力最強，最易引發蛋白氧化[19]。因此測定GAE中總黃酮與總酚含量以及清除自由基的能力可初步了解其抗氧化性能。經測定GAE中總黃酮含量為37.09%，總酚含量為67.50%，說明GAE富含黃酮及酚類物質，具有潛在的抗氧化能力。就清除自由基而言，半抑制濃度越低，表明清除半數自由基所需的量越少，清除效果越佳。如表1所示，GAE清除三種自由基中·OH所需的半抑制濃度最低，其次是ABTS自由基和DPPH自由基。與VC的抑制效果相比，GAE對OH、DPPH、ABTS三種自由基的抑制效果分別約為VC的1/3、1/10、1/7。由圖1也可看出，與VC相比，GAE清除OH自由基的斜率與VC最接近、ABTS自由基次之，DPPH自由基相差最大。由此表明，GAE清除OH和ABTS自由基的能力較強，清除DPPH自由基的能力相對較弱?？偟膩碚f，鼠曲草提取物具有一定清除自由基的效果，可干預調控蛋白質的氧化。高浩祥等[5]也曾驗證過GAE對自由基的清除效果，并將其應用于油脂抗氧化，能有效改善油脂氧化酸敗。

表1 鼠曲草提取物對自由基的半抑制濃度Table 1 Semi-inhibitory concentration of free radical in the extract of Gnaphalium affine

圖1 不同濃度鼠曲草提取物的清除自由基能力Fig.1 Radical scavenging activity of GAE at various concentrations

2.2 不同濃度TP/GAE對MPs中羰基含量的影響

蛋白質中帶有NH或NH2的側鏈氨基酸官能團遇到ROS極易被氧化生產羰基衍生物，因此羰基含量普遍被認為是判斷蛋白質氧化程度的重要指標之一[19]。通常認為羰基含量越高，蛋白氧化越嚴重。如圖2所示，未氧化MPs的羰基含量為1.24 nmol/mg，經·OH氧化體系氧化12 h后，MPs羰基含量顯著升高至2.30 nmol/mg（P＜0.05）。在氧化對照基礎上，TP和GAE的存在均顯著降低了MPs羰基含量（P＜0.05），尤其在高濃度條件下，TP和GAE對羰基的抑制效果分別高達36.89%、38.93%，由此表明TP和GAE均能明顯抑制蛋白氧化，且抑制效果對其濃度具有依賴性，但低濃度條件下TP的抑制效果不及GAE。TP和GAE的添加對MPs羰基含量的影響可能主要歸因于黃酮類、酚類物質是良好的氫供體，具有極強清除自由基的能力[20]。此外，富含黃酮及酚類的物質對MPs羰基化的干預效能，前人已有類似報道：綠茶提取物和迷迭香提取物可有效抑制豬肉香腸中蛋白羰基的生成[21]；桑葚多酚可有效抑制廣東香腸中蛋白羰基生成[22]；甘草提取物可有效抑制豬肉[8]或雞肉[17]貯藏過程中羰基衍生物的產生，因此GAE與眾多天然提取物一樣具有阻礙蛋白羰基化、防止蛋白氧化的潛能。

圖2 氧化及不同濃度TP/GAE對MPs羰基含量的影響Fig.2 Effects of oxidation and different concentrations of TP/GAE on the carbonyl content of MPs

2.3 不同濃度TP/GAE對MPs中總巰基含量的影響

半胱氨酸中的巰基同樣容易被ROS氧化轉化成二硫鍵，因此巰基的損失也可作為蛋白氧化的標志。如圖3所示，未氧化MPs總巰基含量為9.529 μmol/g，經·OH氧化體系氧化12 h后，其總巰基含量顯著降低了16.66%（P＜0.05）。這是由于氧化導致蛋白質結構部分展開，半胱氨酸中的活性巰基暴露，受·OH攻擊后形成二硫鍵或進一步被氧化為磺酸類或其他氧化產物，從而導致巰基損失[23]。在1.2 mg/g和6 mg/g濃度下，TP和GAE的添加所導致MPs巰基損失程度與氧化對照無顯著性差異（P＞0.05）。當TP和GAE的添加量高達30 mg/g時，均顯著降低了MPs巰基含量（P＜0.05）。高濃度TP/GAE在氧化的基礎上進一步促進MPs巰基損失，在OX處理組的基礎上TP、GAE分別損失28.89%、27.40%，可能原因是TP和GAE中的酚類物質與蛋白質相互作用形成“巰基-醌”加合物[24]。酚類物質造成氧化后蛋白巰基的進一步損失也存在類似報道，GUO等[13]研究的六種酚類物質（沒食子酸、綠原酸、沒食子酸丙酯、槲皮素、兒茶素和表沒食子兒茶素沒食子酸酯）在氧化基礎上均進一步顯著降低MPs巰基含量（P＜0.05）。

圖3 氧化及不同濃度TP/GAE對MPs總巰基含量的影響Fig.3 Effects of oxidation and different concentrations of TP/GAE on the content of total sulfhydryl groups of MPs

2.4 不同濃度TP/GAE對MPs中自由氨基含量的影響

賴氨酸中的?-NH2基團非常容易受到自由基攻擊，通過脫氨基過程轉化為羰基，而形成的羰基又可能與NH2共價結合進一步降低自由氨基的含量[25]。如圖4所示，未氧化MPs的自由氨基含量為3.08 nmol/mg，經·OH氧化體系氧化12 h后，其自由氨基含量顯著降低了11.69%（P＜0.05）。GAE的添加對MPs自由氨基的影響較小，與未氧化MPs氨基含量相當。TP的添加并不能有效阻止自由氨基的損失，其損失程度接近氧化空白組，相反高濃度TP的存在進一步加劇了自由氨基的損失，在氧化對照基礎下降低了8.42%。可能原因是測定自由氨基過程中所添加的SDS破壞了非共價相互作用，導致TP的氧化產物醌類或半醌類物質與氨基共價結合生成“氨基-醌”加合物[26]。彭林等[27]的報道表明酚類物質與自由基反應后會轉變為半醌自由基結構或醌類物質，易與暴露在氧化環境中的蛋白巰基和氨基發生加成反應，生成“巰基-醌”和“氨基-醌”加合物。

圖4 氧化及不同濃度TP/GAE對MPs自由氨基含量的影響Fig.4 Effects of oxidation and different concentrations of TP/GAE on the free amino content of MPs

2.5 不同濃度TP/GAE對肌原纖維蛋白結構的影響

2.5.1 不同濃度TP/GAE對MPs二級結構的影響如圖5所示，氧化后MPs的α-螺旋結構明顯減少，無規則卷曲結構增多。ZHANG等[28]也曾報道蛋白氧化會促使α-螺旋結構向β-結構或無規則卷曲結構轉變，導致α-螺旋結構損失。與氧化對照相比，低濃度TP會導致部分β-折疊損失，α-螺旋增加。中、高濃度TP的α-螺旋結構恢復與氧化對照無明顯差異，且α-螺旋向β-折疊或無規則卷曲結構轉變。α-螺旋解旋可能是因為酚類物質所含酚羥基破壞了可維持α-螺旋結構穩定的羰基氧（C=O）和氨基氫（NH）之間形成的氫鍵。與氧化對照相比，低濃度GAE對α-螺旋結構無顯著影響；中濃度GAE進一步促進α-螺旋轉變為β-折疊且α-螺旋解旋率為31.78%，β-折疊增加了20.65%。高濃度GAE促使β-轉角損失，轉變為無規則卷曲結構。這與JIA等[29]發現綠原酸、阿魏酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯三種酚類物質與β-乳球蛋白結合均會誘導α-螺旋結構向β-結構轉變和TANG等[30]發現MP的α-螺旋解旋對迷迭香酸具有濃度依賴性，濃度越高，α-螺旋結構越少的結論大體一致。α-螺旋結構解旋和β-結構損失表明TP/GAE會與蛋白質相互作用，會促使部分蛋白質二級結構無序與松散，有利于促進蛋白質交聯。

圖5 氧化及不同濃度TP/GAE對MPs二級結構的影響Fig.5 Effects of oxidation and different concentrations ofTP/GAE on the secondary structure of MPs

2.5.2 不同濃度TP/GAE對MPs內源性色氨酸熒光的影響 蛋白質所含色氨酸與酪氨酸殘基是蛋白質內源熒光的主要來源[31]。一般來說，當蛋白質處于折疊狀態時，色氨酸及酪氨酸殘基被包埋在蛋白內核，蛋白質熒光強度較高；而當蛋白質結構展開時，色氨酸及酪氨酸殘基暴露在蛋白質表面被溶劑的極性環境屏蔽了部分熒光，則會導致色氨酸熒光猝滅。因此，蛋白質的三級結構的變化常用內源性色氨酸熒光強度進行表征分析[8]。如圖6所示，與未氧化的MPs相比，氧化12 h后MPs的熒光強度降低且出現不太明顯的紅移現象，最大熒光發射值λm從336 nm紅移到337 nm。TP和GAE的添加均進一步導致MPs熒光強度的降低且出現藍移現象。與OX相比，TP的 λm從 337 nm藍 移到334～336 nm，GAE的 λm從337 nm藍移到334～335 nm。TP和GAE兩種物質的加入引起了MPs的λm藍移，表明Trap的微環境變得更加疏水。此處與邵曉等[32]所研究槲皮素和蘆丁對MPs的影響結果一致。在氧化對照基礎上，色氨酸熒光強度隨著TP和GAE兩種物質濃度的升高而急劇降低。可能原因是氧化后蛋白質三級結構展開，TP和GAE與色氨酸及酪氨酸殘基結合部分屏蔽了熒光發射，或是TP和GAE中含有水溶性酚類，提高了色氨酸微環境極性[33]。

圖6 氧化及不同濃度TP/GAE對MPs內源性色氨酸熒光的影響Fig.6 Effects of oxidation and different concentrations of TP/GAE on endogenous tryptophan fluorescence of MPs

2.5.3 不同濃度TP/GAE對MPs表面疏水性的影響表面疏水性反映的是蛋白質表面的疏水性氨基酸殘基的數量，蛋白質去折疊暴露在表面的疏水性氨基酸越多，表明疏水性越大[34]。通常BPB用于結合蛋白質分子表面的疏水性結合位點，因此蛋白質表面疏水性常用表征方法是蛋白質與BPB的結合量[35]。如圖7所示，未氧化MPs的BPB結合量為19.99 μg，氧化后其顯著增加了14.27%（P＜0.05）。這是因為蛋白質暴露于氧化環境中導致部分蛋白結構展開，暴露在蛋白質表面的疏水性殘基與BPB結合使得蛋白質表面疏水性增強[23]。TP和GAE的添加均引起了蛋白質結構的展開，濃度越高，MP的表面疏水性越大，尤其是濃度為30 mg/g時，與氧化對照相比，兩種添加物處理組的BPB結合量分別顯著上升了20.01%、10.97%（P＜0.05）。結合色氨酸熒光分析結果，進一步表明TP和GAE的添加均會促進蛋白結構的進一步展開，暴露更多的疏水性殘基，從而有利于多酚與蛋白質發生疏水相互作用。

圖7 氧化及不同濃度TP/GAE對MPs表面疏水性的影響Fig.7 Effects of oxidation and different concentrations of TP/GAE on the surface hydrophobicity of MPs

2.6 不同濃度TP/GAE對MPs溶解度的影響

蛋白質溶解度可從側面反映其表面疏水情況，通常表面疏水性越大，溶解度便越小[8]。如圖8所示，溶解度的變化趨勢正好與表面疏水性相反，與未氧化MPs相比氧化后的MPs溶解度從71.32%顯著降低至45.78%（P＜0.05）。TP和GAE的存在均進一步促進MPs溶解度降低，TP處理組更為顯著（P＜0.05）。蛋白質溶解度下降的原因可能是蛋白質分子間的靜電斥力減弱或疏水基團相互作用導致蛋白分子部分聚集，從而引起溶解度下降[36]。周揚等[18]研究的酚類物質迷迭香酸的添加同樣會導致肌球蛋白表面疏水性升高且溶解度降低。

圖8 氧化及不同濃度TP/GAE對MPs溶解度的影響Fig.8 Effects of oxidation and different concentrations of TP/GAE on the solubility of MPs

3 結論

茶多酚和鼠曲草提取物的添加對MPs的氧化狀態及結構變化都產生了介導調控作用。GAE清除自由基和羰基含量測定結果表明，GAE清除·OH的能力最強，與TP一樣能有效抵抗·OH引發的MPs的氧化，抗氧化效果顯著（P＜0.05）。巰基和自由氨基含量的測定結果表明，TP的存在會進一步促進MPs巰基和自由氨基的損失，且高濃度（30 mg/mL）損失更為嚴重，但GAE的存在僅明顯促進MPs巰基損失，對自由氨基的影響較小。傅立葉變換紅外光譜、色氨酸熒光、表面疏水性和溶解度表明，TP和GAE的存在促進了MPs結構展開、色氨酸殘基暴露，導致α-螺旋含量降低、色氨酸熒光猝滅、表面疏水性增加和溶解度下降。因此，GAE對MPs氧化和結構的介導調控可為植物提取物用于蛋白抗氧化和蛋白結構改性提供理論參考。