CEACAM5在肺腺癌中的表達及臨床意義

劉傳 李麗娟 王嶸 湯兵祥

肺癌是一種由支氣管黏膜或腺體引發的常見惡性腫瘤，臨床癥狀表現為干咳、胸痛、氣急等。惡性腫瘤具有侵襲周圍組織和轉移到遠處器官的能力，最終會導致腫瘤治療失敗[1]。在惡性腫瘤中，肺癌發病率及死亡率居于首位[2]，且呈上升趨勢，全球肺癌患者5年生存率為10%-15%，在中國僅5.5%左右[3]，嚴重危害人類健康。癌胚抗原相關細胞黏附分子5(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5，CEACAM5)屬于免疫球蛋白CEACAMs家族，有研究證實CEACAMs家族在惡性腫瘤中有重要的檢測價值，比如，CEACAM5 mRNA雙標記的循環腫瘤細胞(CTCs)提示乳腺癌患者預后不良[4]，食管腺癌患者CEACAM1高表達[5]。目前關于CEACAM5基因在肺腺癌中的表達研究較少，有關肺腺癌發生機制尚不明確，本研究采用免疫組化法檢測肺腺癌患者中CEACAM5基因表達情況，并利用Ualcan數據庫(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)分析CEACAM5在肺腺癌中的表達情況以及和預后的關系，探究CEACAM5和肺腺癌中的關系和臨床學意義，為進一步探索肺腺癌發生發展的分子機制奠定基礎。

資料與方法

一、一般資料

1 經本院醫學倫理委員會討論后批準，選擇2016年8月-2017年8月在本院確診為肺腺癌的患者51例，取肺腺癌患者病變肺部組織作為實驗組；從中隨機選取42例，取癌旁組織作為對照組。本組所有患者均符合肺腺癌的國際多學科新分類方案中診斷標準[6]。納入標準：① 確診為肺腺癌；② 臨床病理資料完整；③ 無明顯肝腎功能損壞；④ 患者及家屬知情并自愿參加此次研究。排除標準：① 因其他原因中途停止參與者；② 具有惡性腫瘤史及其他部位原發腫瘤者；③ 曾接受放療、化療、免疫治療。術后對所有患者進行3年隨訪，每3-6個月通過電話或門診進行隨訪，截至患者死亡或隨訪至2020年2月，期間無失訪案例。

2 主要試劑與儀器

鼠抗人CEACAM5單克隆抗體(貨號：MAB3848)，艾美捷科技有限公司；SP試劑盒(貨號：XY-SP-Hu)，上海信裕生物科技公司；DAB顯色劑(貨號：CTS010)，上海嶸葳達實業有限公司。

二、實驗方法

1 取材及免疫組化檢測

手術中取受試者的肺腺癌組織和癌旁組織，將肺腺癌組織和癌旁組織均切成2～3微米切片，先用10%福爾馬林溶液固定，經常規石蠟包埋制成4 μm厚切片備用。采用免疫組織化學染色法檢測CEACAM5蛋白表達水平，染色方法嚴格按照試劑盒說明書進行操作，酒精脫蠟，PBS沖洗3次，梯度酒精水化，然后在枸櫞酸鹽緩沖液(0.01 M，PH6.0)中加熱20 min修復抗原，PBS沖洗切片3次；晾干后滴加5%山羊血清蛋白孵育30 min；加抗體，4 ℃孵育12 h；復溫90 min，PBS清洗后加二抗，39 ℃環境下孵育25 min，然后用PBS清洗3次；(4)采用DAB顯色劑染色，蘇木素復染、顯色后，自來水沖洗，二甲苯固定3次，每次5 min，風干后封片，并將處理好的切片在光學顯微鏡下觀察，每張切片隨機選取5個400倍鏡視野進行陽性細胞計數。

2 染色及判定標準

CEACAM5陽性為細胞膜以內細胞核以外出現顆粒狀棕黃色，判定標準是細胞染色百分比及染色程度。按染色程度評分：基本無色(0分)，淺黃色(1分)，深黃色(2分)，褐色(3分)；按陽性細胞染色百分比評分：陰性(0分)，25%以下(1分)，25%-50%(2分)，50%以上(3分)。免疫組化評分(染色程度評分×陽性細胞百分率評分)為最終評分：≤1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為陽性()，>6分為強陽性()，定義陰性組包含陰性和弱陽性，陽性組包含陽性和強陽性。

三、統計學方法

用SPSS 23.0對數據統計，計數資料以率表示，行卡方檢驗；計量資料采用均數±標準差表示，采用t檢驗；采用UALCAN數據庫分析肺腺癌中CEACAM5的表達與性別、年齡、吸煙史之間的關系以及預后情況；采用Kaplan-Meier生存曲線對肺腺癌患者進行生存分析，并分析肺腺癌中CEACAM5與CEACAM6、CEACAM1相關性。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、一般資料比較

實驗組和對照組性別、年齡、吸煙史、臨床分期等資料比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)所示。

表1 一般資料比較

二、Ualcan數據庫分析CEACAM5在肺腺癌中的表達

Ualcan數據庫顯示，CEACAM5在肺腺癌組織中的表達高于正常組織(P<0.05)；CEACAM5在正常組織中表達水平低于患肺腺癌男性患者、女性患者(P<0.05)；CEACAM5在正常組織中表達水平低于≥41歲的肺腺癌患者(P<0.05)；CEACAM5在正常組織中表達水平低于肺腺癌各臨床分期的表達水平(P<0.05)(見圖1)。

三、兩組中CEACAM5的表達及與肺腺癌臨床病理特征的關系

實驗組CEACAM5陽性表達率62.75%(32/51)高于對照組陽性表達率21.43%(9/42)(χ2=15.950，P<0.001)(見圖2)。其中CEACAM5陽性組在年齡、臨床分期、淋巴結轉移、腫瘤分化程度、腫瘤大小與陰性組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而陽性組和陰性組性別上差異無統計學意義(P>0.05)( 見表2)。

表2 CEACAM5表達和肺腺癌臨床病理特征的關系[n(%)]

四、CEACAM5與肺腺癌預后的關系

根據Ualcan數據庫分析，肺腺癌CEACAM5高表達者126例，中低表達者376例，比較高、低表達者的遠期生存狀況，結果顯示CEACAM5高表達的肺腺癌患者遠期生存率與低表達患者相比差異無統計學意義(P=0.53)。見圖3A。而本研究根據Kaplan-Meier生存曲線分析肺腺癌患者3年生存率，CEACAM5陽性表達患者生存率50.0%(16/32)低于陰性表達生存率78.9%(15/19)，兩組比較log-rank值為4.324，P=0.038。見圖3B。同時經COX回歸分析顯示，CEACAM5及臨床分期、淋巴結轉移均是影響肺腺癌預后的危險因素(見表3)。

圖3 CEACAM5表達與肺腺癌預后的關系

五、CEACAM5與CEACAM6、CEACAM1相關性分析

應用Pearson相關性分析，發現CEACAM5與CEACAM6、CEACAM1存在明顯的相關性(r=0.48，0.43，P<0.05)(見圖4)。

圖4 肺腺癌中基因CEACAM5與CEACAM6、

討 論

肺腺癌病情發展緩慢，惡性程度低，但因為存在微轉移灶，使其向血管和淋巴等轉移，發現時已是癌癥中晚期[7]。從1965年至今，CEACAM5在各種癌癥中的研究逐漸增多，比如呼吸道、胃腸道以及乳腺腫瘤等，CEACAM5在惡性腫瘤中至關重要。有研究表明，CEACAM5在腫瘤細胞分化、增殖過程中起調節作用，高表達CEACAM5使細胞極性和正常組織結構遭到破壞，影響細胞的分化成熟，其抗失調凋亡的功能，制約著惡性腫瘤的分化和侵襲[8-9]。但CEACAM5和肺腺癌的研究較少，因此探尋CEACAM 5與肺腺癌關系及發病機制至關重要。

CEACAM5是哺乳動物免疫球蛋白家族的糖蛋白之一，通過與同源性蛋白以及異源性蛋白相互作用調節細胞粘著性，對細胞識別有重要作用[10]。馮世兵[10]研究CEACAM5在胃良惡性病變中的表達時指出，CEACAM5在正常胃黏膜上皮中不表達，在胃良性和惡性病變患者的細胞膜或細胞質中表達，且細胞膜與細胞質混合表達增加。此外，CEACAM5在腫瘤細胞的細胞膜和細胞質表達，分別代表著癌前病變以及腫瘤侵襲和轉移，胃癌前病變的標志物是膜染色，是良惡性的標志[10]。本研究數據顯示肺腺癌患者癌組織中CEACAM5陽性率比癌旁組織高，和Ualcan數據庫分析的結果一致，表明CEACAM5可能參與肺腺癌的發生發展。CEACAM5是人類組織和腫瘤細胞分化及增殖的重要調節分子，CEACAM5 在結、直腸癌樣本中高表達，與結、直腸癌病程進展密切相關，可作為結直腸癌肝轉移早期復發的預測標志[9，11]。CEACAM5表達量的升高可能說明惡性程度嚴重、侵襲能力強、轉移率高、預后性差[12]。有研究比較了乳腺癌治療前后CEACAM5mRNA CT值水平變化與預后的關系,發現治療后CEACAM5 mRNA降低的患者預后要優于未降低[4]。本研究結果顯示CEACAM5陽性表達患者的3年生存率低于陰性患者，同時經COX回歸分析顯示，CEACAM5及臨床分期、淋巴結轉移均是影響肺腺癌預后的危險因素，提示CEACAM5陽性表達可能是肺腺癌患者預后不良的影響因素。而單因素分析顯示年齡及腫瘤大小是影響患者預后的相關因素，而經多因素分析顯示并非影響預后的危險因素，與虞林湘等[13]研究相似，但也可能受研究對象較少而影響結果準確性，因此仍有待擴大樣本進一步明確相關危險因素。Ualcan數據庫分析顯示，CEACAM5高、低表達患者遠期生存率差異無統計學意義，與本研究結果不一致，可能是因為本研究隨訪時間較短，樣本量較少，從而導致研究結果存在差異。

CEACAM1是免疫球蛋白超家族成員之一，亦是一種抑制腫瘤的蛋白，通過提升表達量，維持上皮細胞正?；蛐?，應對腫瘤病發[14]。CEACAM1已被證實參與調節接觸依賴性腫瘤免疫反應。以往研究表明，CEACAM1在胃癌及口腔癌血管生成中起重要作用。CEACAM1在食管腺癌組織中表達水平明顯增高,其表達與食管腺癌患者病理分化與分期及預后有關,表明CEACAM1可能是食管癌的新靶點[5]。CEACAM6屬于細胞表面糖蛋白，經糖基磷脂酰肌醇固定在細胞膜上，在致癌因子刺激下，CEACAM6表達升高，使腫瘤細胞增殖、活性提高[15]。有研究認為CEACAM6腫瘤中高表達與耐受失巢凋亡現象相關[16]。Ualcan數據庫分析顯示，CEACAM5和CEACAM6、CEACAM1在肺腺癌中均呈正相關，可能是CEACAM5、CEACAM1、CEACAM6在肺腺癌中有協同作用，共同參與調控肺腺癌的發生發展，說明CEACAMs家族在致癌機制上可能存在一定聯系；通過進一步分析顯示，CEACAMs家族中 CEACAM分子均是連接在細胞膜上的，其中CEACAM5和CEACAM6以及CEACAM7主要是通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)與細胞膜連接的，而CEACAM1主要是通過疏水的跨膜結構連接在細胞膜上的，其配體可能和GPI連接分子的相互作用，或通過CEACAM1的跨膜結構域將信號傳入細胞內[17]，但是由于目前關于各個分子的生物學功能是否存在受體復合體系統目前尚不明確，因此CEA基因家族在腫瘤的發生發展及轉移中扮演的角色還需要進一步研究。

綜上所述，肺腺癌患者癌組織CEACAM5陽性率高于癌旁組織，CEACAM5與CEACAM6、CEACAM1存在明顯的相關性，CEACAM5表達與肺腺癌患者預后密切相關，可能是治療肺腺癌的潛在靶點。但是由于肺腺癌發生機制尚不清楚，且本研究選取樣本數量較少，未選取健康對照及良性病變組進行鑒別分析等諸多不足之處，同時關于其CEACAM5對肺腺癌患者的診斷及預后評估價值尚未進行分析，導致本研究不能準確反映CEACAM5與肺腺癌確切關系，還有待進一步研究。