四川地區結核分枝桿菌katG、inhA和rpoB基因突變位點耐藥水平及突變頻率特征分析

陳蕾

結核病是威脅人類健康的重要公共衛生問題之一，隨著耐多藥結核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結核病(XDR-TB)患者的日益增多，結核病防控工作面臨前所未有的挑戰。2020年，世界衛生組織(WHO)報道全球MDR-TB或利福平耐藥結核病(RR-TB)的治療成功率為57%，我國僅為54%[1]。對此類肺結核的早期、快速診斷有利于臨床采取有效、合理的治療方案，而可靠的分子或表型藥敏方法是確診MDR-TB或 RR-TB以及選擇藥物的重要工具[2]。近年來國內外報道基因芯片技術對MDR-TB的診斷具有快速、靈敏、高通量等許多優點[3]，不同抗結核藥物的耐藥相關基因在耐藥突變株中發生的頻率差異較大，且引起的耐藥水平也存在差異性[4-5]。因此，本文采用基因芯片法(芯片法)通過katG、inhA和rpoB基因突變位點檢測耐藥基因，微孔板比例法(比例法)通過培養+藥物敏感性試驗檢測表型耐藥水平，分析基因突變位點與耐藥水平關系及突變頻率分布特點，為本地區臨床治療方案選擇提供指導。

資料與方法

一、標本來源

收集2020年1月至2021年1月成都市公共衛生臨床醫療中心住院肺結核患者痰標本，選取經液體培養陽性且菌種鑒定為人型結核分枝桿菌(Mtb)的分離株，進行比例法檢測H或R耐藥性為表型耐藥，同時完成芯片法檢測H或R耐藥基因為突變型，共計獲得118例Mtb菌株(患者118例)。

二、儀器和試劑

儀器：結核分枝桿菌耐藥DNA芯片檢測試劑盒、PCR擴增儀、芯片雜交儀、微陣列芯片掃描讀片儀均由北京博奧生物技術有限公司提供；BACTECTMMGIT 960全自動分枝桿菌檢測/藥敏系統購自美國BD公司。

試劑：試驗所用分枝桿菌液體MGIT培養基由美國BD公司提供。

三、檢測方法

1 標本采集 按照結核病實驗室標準化操作流程[6]收集合格的痰標本，標本量3～5mL，對不合格的標本重新留取。對同一份痰標本進行比例法檢測耐藥表型、芯片法檢測耐藥基因。

2 微孔板比例法檢測H和R耐藥表型

采用BACTEC MGIT 960培養基，按照《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》[7]的要求進行培養，培養產物均使用硝基苯甲酸(PNB)/噻吩-2-羧酸肼(TCH)指示劑初步鑒定為Mtb和非結核分枝桿菌。將分離的Mtb菌株，采用微孔板比例法，按照《結核病實驗室檢驗規程》[8]的要求進行藥敏試驗。判斷耐藥標準：含藥培養基上菌落數/對照培養基上菌落數≥1%為生長。對照管生長，含藥濃度管不生長為敏感，含藥濃度管生長為耐藥。2種含藥液體培養基的藥物高低濃度分別為H0.80 μg/mL、0.40 μg/mL,R 8.00 μg/mL 、4.00 μg/mL。

3 基因芯片法檢測katG、inhA和rpoB基因突變位點

取1 mL標本按基因芯片儀器使用操作說明測試。通過檢測位點的突變情況判斷耐藥性，如R耐藥相關基因ropB基因511(T→C)、513(C→A)、516(G→T,A→T,A→G)、526(C→T,C→G,A→T,A→G)、531(C→T,C→G)、533(T→C)位點及H耐藥相關基因katG基因的315(G→C,G→A)位點和inhA基因的-15(G→T)位點。如果耐藥相關基因為野生型，判斷為相應藥物敏感，如耐藥相關基因為突變型，判斷為相應藥物耐藥。

四、統計學分析

應用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。多組計數資料采用χ2檢驗，理論頻數1≤T<5，計算校正χ2值，P<0.05為差異有統計學意義，多組計數資料兩兩比較采用P值修正的方法，即三組之間兩兩比較P<0.05/3=0.0167認為差異有統計學意義。

結 果

一、基本情況

納入分析的118例Mtb菌株中，H耐藥株85例，R耐藥株99例，MDR株66例。男性85例，占72.03%(85/118)，女性33例，占27.97%(33/118)。年齡11～88歲，平均年齡42±11.28歲。患者分別來源于成都地區47例(39.83%，47/118)，三州地區32例(27.12%,32/118)，四川其他地區14個地級市共計39例(33.05%,39/118)。

二、H耐藥相關基因katG、inhA基因突變位點與表型耐藥水平的關系

H耐藥株85例中，單基因耐藥株84例(98.82%,84/85),其中katG71例(84.52%，71/84)、inhA13例(15.48%，13/84)。雙基因耐藥株1例(1.18%,1/85)。總體高濃度耐藥(高耐藥)71例(83.53%，71/85)，低濃度耐藥(低耐藥)14例(16.47%，14/85)。不同單基因突變位點耐藥水平比較，katG與inhA高耐藥率分別為92.96%(66/71)、30.77%(4/13)，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。雙基因耐藥株1例為高耐藥(見表1)。

表1 katG、inhA單基因位點與表型耐藥水平的關系

三、R耐藥相關基因rpoB基因突變位點與表型耐藥水平的關系

R耐藥株99例中，單基因耐藥株95例(95.96%,95/99),其中ropB531位點49例、ropB526位點22例、ropB533/516/513/511位點24例。雙基因耐藥株4例(4.04%,4/99)。總體高耐藥77例(77.78%，77/99)，低耐藥22例(22.22%，22/99)。不同單基因突變位點耐藥水平比較，rpoB531、rpoB521、rpoB533/516/513/511高耐藥率分別為93.88%(46/49)、81.82%(18/24)、37.5%(9/24)，三者比較差異有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較中，ropB531與ropB533/516/513/511 及ropB526與ropB533/516/513/511 比較高耐藥率，差異均有統計學意義(P<0.0167)；ropB531與ropB526 比較差異無統計學意義(P>0.0167)。雙基因耐藥株4例均為高耐藥(見表2)。

表2 rpoB單基因位點與表型耐藥水平的關系

四、katG、inhA和rpoB基因位點突變頻率

118例患者標本進行耐藥基因突變位點統計，芯片法檢測H耐藥株85例中katG基因315單位點突變率最高達84.43%(71/85)，其次為inhA基因-15單位點13.93%(13/85)，最低為雙基因katG315+inhA-15位點1.64%(1/85)。R耐藥株99例中基因位點突變率從高到低依次為ropB531單位點49.50%(49/99)、ropB526單位點22.22%(22/99)、ropB511單位點11.11(11/99)、ropB516單位點8.08(8/99)、ropB533單位點3.03(3/99)、ropB513單位點2.02(2/99)；雙基因和多基因位點突變率分別為3.03%(3/99)、1.01(1/99)。MDR株66例中耐藥基因位點突變率從高到低依次為katG315+ropB531位點43.94%(29/66)、katG315+ropB526位點21.21%(14/66)、katG315+ropB511位點6.06%(4/66)及inhA+ropB5316.06%(4/66)、katG315+ropB533位點4.55%(3/66)及katG315+ropB516位點4.55%(3/66)及inhA+ropB526位點4.55%(3/66)、katG315+ropB513位點1.52%(1/66)；多基因位點突變率7.58%(5/66)(見表3)。

表3 katG、inhA和rpoB基因位點突變頻率

討 論

異煙肼耐藥相關基因katG和inhA的耐藥水平比較

Mtb的耐藥主要是藥物作用靶基因突變引起的。H耐藥主要途徑：H需要經Mtb觸酶-過氧化物酶活化后才發揮作用，該酶由katG基因所編碼，katG基因突變導致90%以上的H耐藥株產生，其最普遍的變異發生在第315位點上，表型耐藥水平為中等到高水平耐藥[9]。本文中katG基因高濃度耐藥率92.96%明顯高于inhA基因30.77%，與其他研究者耐藥水平略有差異，但總體一致[10-11]，說明katG基因有總體耐藥水平高的特點。但該位點71株中仍有5株為低濃度耐藥，提示katG基因其他位點上存在變異，導致Mtb對H產生不同水平的耐藥性和保留不同的觸酶-過氧化物酶活性。其次途徑：inhA基因的調節序列上發生單堿基插入變異時，使inhA蛋白過度表達從而使H活性不同程度的降低，導致10%左右的H耐藥株產生，其表型耐藥水平大多數為低水平耐藥[9]，本次研究中inhA低耐藥率69.23%(9/13)也證實了這一特點。本文inhA-15位點13株中仍有4株為高濃度耐藥，提示inhA基因低耐藥有不穩定性的特點。 此外雙基因katG+inhA突變株也為高濃度耐藥，提示當單獨存在katG基因突變或inhA啟動子合并katG基因突變時耐藥水平較高，表明高劑量異煙肼是無效的，因此在MDR-TB和RR-TB患者中，不應使用全口服MDR-TB短程方案[12]。本地區katG、inhA基因突變位點總體高濃度耐藥率達 83.53%,也進一步提示本地區使用高劑量異煙肼必須結合快速分子藥敏檢測，在H敏感或低濃度耐藥時才能慎重使用。

利福平耐藥相關基因ropB各突變位點耐藥水平比較

R耐藥主要途徑：R與MtbDNA依賴的RNA聚合酶β亞單位(ropB)結合后抑制其活性導致細胞死亡。β亞單位由ropB基因編碼，其核心保守區域出現突變造成97%的R耐藥株產生，最集中的突變位于531或526位點，并導致高度耐藥，而511、516、518和522位點與低水平耐藥相關[13]。本文中ropB531、ropB526高濃度耐藥率分別為93.88%、81.82%，兩者高耐藥水平相似，無統計學差異，但均遠高于rpoB511/513/516/533位點耐藥水平，此外雙基因3株及多基因1株突變株全部為高濃度耐藥，均與ropB531、ropB526位點突變有關。6位點總體高耐藥率達77.78%，提示本地區R耐藥位點耐藥水平高，臨床使用必須規范 治療同時加強藥敏檢測，避免耐藥產生。

katG、inhA和rpoB基因位點突變頻率比較

本研究收集的住院患者來自四川省各地，成都地區、三州邊遠地區、四川其他地區分別占39.83%、27.12%、33.05%，能較好代表四川地區地域分布特點。在耐藥基因位點突變頻率分布中發現：四川地區H耐藥相關基因以單基因突變為主，katG主要突變形式為(AGC→ACC) Ser→Thr(S315T),占H耐藥突變株的84.43%，其次為inhA突變率13.93%，雙基因突變率僅有1.64%； R耐藥相關基因rpoB也以單基因突變為主，主要突變形式為RRDR-531(TCG→TTG) Ser→Leu,占R耐藥突變株的55.81%，其次為526、511位點突變率分別為13.95%、11.11%，雙基因及多基因位點突變率僅有4.04%；MDR耐藥相關基因主要突變形式為katG315+ropB531，占MDR耐藥突變株的43.94%。這與揚州、深圳、海南等地區頻率分布不盡相同，提示katG、inhA和rpoB基因位點突變頻率分布存在地域性差異[14-16]。

總之，四川地區H、R耐藥株的耐藥水平高，基因突變位點與耐藥水平密切相關。katG、rpoB531/526與H、R 高耐藥水平有關，inhA、rpoB511/513/516/533與H、R 低耐藥水平有關。katG315、rpoB531是H、R耐藥相關基因突變的主要形式，臨床使用抗結核藥物須密切結合快速藥敏檢測制定方案。本次研究由于樣本量局限未能進一步研究突變頻率較少的H、R耐藥相關基因位點對不同表型耐藥水平的影響，希望在以后進一步開展相關研究。