大口黑鱸苗種致病性類志賀鄰單胞菌的分離和鑒定

慶輝 周國勤 陸健 張佳佳 王佩佩

(南京市水產科學研究所，江蘇南京 210036)

加州鱸又名大口黑鱸(Micropterussalmoides)，隸屬于鱸形目、太陽魚科、黑鱸屬，原產于美國加利福尼亞州密西西比河水系，20世紀80年代被引入中國，因其具有適應性強、養殖周期短，營養豐富、肉質鮮美等優點而受到養殖者和消費者的喜愛，是深受市場歡迎的優質特色淡水養殖品種[1-2]。近年來，隨著大口黑鱸專用人工配合飼料的成功研發，大口黑鱸的養殖產量有了大幅提升。但伴隨高密度養殖而來的是病害也隨之增多。近年來，由于水體污染、管理不善等因素的影響，大口黑鱸的病害呈現多樣化的特點，給養殖戶帶來了嚴重的經濟損失。

2021年3月初，江蘇省南京市的某養殖戶反映，其溫室養殖的大口黑鱸魚種開始零星死亡。該養殖戶自行使用聚維酮碘全池潑灑，連續用藥4 d，但病情未見好轉，且魚種死亡數量日漸增多。本試驗采用理化方法和分子生物學方法對該溫室患病大口黑鱸的病原進行了研究，以期為診斷、防治大口黑鱸苗種病害提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

患病大口黑鱸來自江蘇南京某養殖場育苗溫室，3月齡，體質量25～35 g，臨床癥狀表現為患病個體反應遲鈍，離群獨游，鰭部潰爛、出血，肛門紅腫，食欲下降。

試驗所用胰蛋白大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白大豆肉湯(TSB)均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司。藥敏分析試劑板購自南京菲恩醫療科技有限公司。所有化學試劑均為分析純。DNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 病原菌的分離與純化

取瀕死的病魚，現場用70%的酒精棉球反復擦拭消毒病魚的腹部和體表，用無菌剪刀打開腹腔，無菌操作取病魚肝臟、脾臟，劃線接種于血平板，35 ℃培養24 h后觀察發現，有1個菌落出現微溶血現象。挑取此菌落，劃線接種于普通營養瓊脂培養基上，35 ℃純化培養24 h，將純化后的菌株在TSB液體培養基中增殖備用，并將該分離菌株編號為Q-1。取少量純化菌置于載玻片上，經革蘭氏染色后進行顯微鏡觀察。

1.3 回歸感染試驗

將菌株Q-1無菌接種至TSA平板上，35 ℃培養20～24 h后，挑取單一菌株至TSB液體培養基中，以180 r/min、35 ℃培養至穩定期(20～24 h)。細菌懸液離心去上清液后，用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋后涂布于TSA培養基上，平板計數，計算出細菌懸液濃度為5.0×108cfu/mL。隨后，用無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)制備菌懸液。

選取相同規格的健康的大口黑鱸40尾，平均分為A、B兩組，采用兩種不同感染方式進行試驗，并分別設置對照組進行對照。

腹腔注射感染試驗：將濃度為1.0×108cfu/mL的菌懸液，以腹腔注射(0.3 mL/尾)的方式進行人工感染，對照組則注射同量無菌PBS緩沖液。

浸浴感染試驗：選擇體表無損傷的健康大口黑鱸，放入含菌量1.0×108cfu/mL的曝氣自來水中進行暫養觀察，對照組不加菌液。

1.4 病原菌的鑒定

試驗采用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB法)提取細菌DNA。提取的細菌DNA經核酸電泳驗證后，置于-20 ℃冰箱保存。擴增引物為：27F(5′-agagtttgatcctggctcag-3′)/1492R(5′-tacggttaccttgttacgactt-3′)。反應總體系50 μL：Master Mix 25 μL，去離子滅菌水20 μL，DNA模板3 μL，上、下游引物各1 μL。

16S rRNA基因擴增反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共34個循環；72 ℃延伸7 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，進行T載體克隆，并對重組質粒進行測序。測序工作由生工生物工程(上海)有限公司完成。測序結果比對拼接后在National Center for Biotechnology Information(NCBI)上在線分析。

1.5 生化檢測

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[3]中的細菌鑒定方法，對完成增殖的Q-1菌株進行各項生化指標測定。

1.6 藥敏試驗

選用FIEN-MED藥敏分析試劑板對Q-1菌株進行抑菌試驗。該藥敏分析試劑板的主要成分及板條設置見表1。

表1 藥敏分析試劑板的主要成分及板條設置 單位：μg/mL

2 結果和分析

2.1 病原菌的分離和純化

將菌株Q-1接種到TSA培養基，于35 ℃培養24 h后，可見其生長良好，菌落呈圓形、中央微隆起、呈半透明、表面濕潤光滑邊緣整齊，整體呈灰白色、半透明。經革蘭氏染色后觀察發現，該菌株為革蘭氏陰性桿菌(見圖1)。

圖1 分離菌株Q-1革蘭氏染色

2.2 回歸感染試驗

由表2可見，試驗組20尾大口黑鱸注射或浸浴接種Q-1菌株后，3 d內全部死亡，致死率為100%。其中采用腹腔注射感染的試驗組大口黑鱸24 h后即出現死亡，60 h內全部死亡。采用浸浴感染的試驗組大口黑鱸36 h后出現死亡，72 h內全部死亡。人工感染致死的大口黑鱸所表現出的臨床癥狀與患病大口黑鱸一致，且從其體內分離到與Q-1菌株形態特征、生化性質一致的細菌，而對照組魚沒有出現死亡，也未分離出該細菌。

表2 回歸感染試驗結果

2.3 16S rRNA序列分析

采用試劑盒提取菌株Q-1的DNA，以其為模板進行16S rRNA基因PCR擴增。將PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得的目的片段長約1 500 bp(見圖2)。將目的片段回收測序，經BLAST比對，B-1菌株與類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)(登錄號：KC633882.1)的同源性為100%。

注：Marker為DNA分子質量標準。

2.4 生化檢測

生化檢測結果顯示(見表3)，分離菌株Q-1的生化特性與類志賀鄰單胞菌一致，結合16S rRNA序列分析結果，鑒定菌株Q-1為類志賀鄰單胞菌。

表3 分離株Q-1的生理生化特征

2.5 藥敏試驗

根據FIEN-MED藥敏分析試劑板的使用說明書判斷結果，分離菌株Q-1對恩諾沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環素和氟甲喹敏感，對甲砜霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉和磺胺甲惡唑+甲氧芐啶耐藥(見表4)。

表4 分離株Q-1的藥敏試驗結果

3 討論

類志賀鄰單胞菌是1種厭氧性的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于自然界，尤其在水中和動物體內更為常見，是人-畜-魚共患的條件致病菌。人們在飲用生水或食用未煮透的水產品時，容易感染類志賀鄰單胞菌，引起腸胃炎、腦膜炎、肺炎、骨髓炎、角膜炎、敗血癥等疾病[4-6]。淡水魚是類志賀鄰單胞菌常見的天然宿主[7]，對該菌的報道已見于黃顙魚、斑點叉尾魚回、淡紅墨頭魚、鱘魚、異育銀鯽、草魚、黃鱔等[8-14]。為了減少人類感染類志賀鄰單胞菌的風險，必須對發病池塘加強管理，做好水體消毒工作，養殖尾水不能隨意排放，以免發生交叉感染。

目前，對從急性腹瀉、食物中毒的患病人群中分離出的類志賀鄰單胞菌的致病機理研究相對較多，但對從病魚來源的類志賀鄰單胞菌的致病機理研究較少。本研究在江蘇省南京市某養殖場的患病大口黑鱸組織中分離得到類志賀鄰單胞菌菌株，此前未見有相關報道。通過對分離菌株進行革蘭氏染色、16S rRNA序列分析、生化檢測，并進行了藥敏試驗和回歸感染試驗，結果表明，該菌株為類志賀鄰單胞菌，且可確定其為病原菌。藥敏試驗結果表明，分離菌株Q-1對恩諾沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環素和氟甲喹敏感，對甲砜霉素、磺胺間甲氧嘧啶鈉和磺胺甲惡唑+甲氧芐啶等耐藥。這一結果與從其他病原生物中分離得到的菌株的藥敏結果存在差異[8-14]。這些菌株間的耐藥性差異可能是動物源不同或環境不同導致的。

近年來，由類志賀鄰單胞菌引起的養殖魚類病害屢有發生，對水產養殖業造成了較大損失，同時也是食品安全的潛在風險。因此，有必要對魚源致病性類志賀鄰單胞菌的致病機理和防控措施進行深入研究，以期及早開發出預防疫苗、快速診斷試劑盒和新型非抗生素藥物等，這對預防和診治該類魚病并控制其傳播及流行具有重要意義。