牙髓干細(xì)胞靜脈注射與聯(lián)合髓芯減壓治療兔早期激素型股骨頭壞死的對比研究

魯 洋， 劉 飛， 王新民， 許 杰， 白玉璽， 呂 劍

(河北省秦皇島市第一醫(yī)院骨科, 河北 秦皇島 066000)

股骨頭壞死(Osteonecrosis of femoral head, ONFH)在臨床上較為常見，多見于20～50歲的人群，如早期未及時治療，患者2年內(nèi)發(fā)生股骨頭塌陷的幾率可高達70%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，由此可見早期干預(yù)對于ONFH患者預(yù)后的重要[1]。早期ONFH的保髖治療方法眾多，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stem cells, BMSCs) 移植治療股骨頭尚未塌陷的早期ONFH是目前公認(rèn)的未見明顯副反應(yīng)且有效的方法。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可促進壞死區(qū)骨組織的修復(fù)、減輕髖部疼痛癥狀、延緩病情進展[2]。本研究通過局部注射醋酸潑尼松龍建立兔激素性股骨頭壞死模型，并將牙髓基質(zhì)干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)分別以靜脈注射及髓芯減壓后隧道內(nèi)注射兩種方式給藥，探討不同給藥方式的有效性，為臨床治療早期股骨頭壞死提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物:健康成年雄性日本大耳兔47只，體重2.0～2.5Kg，免疫合格，飼養(yǎng)于恒溫、恒濕環(huán)境中(湖北逸摯誠生物科技有限公司提供[SCXK(鄂)2016-0020]，質(zhì)量合格證號：42817300000855。由武漢云克隆龍科技股份有限公司飼養(yǎng)[許可證號：SYXK(鄂)2018-0069]。

1.1.2實驗試劑、耗材及儀器:牙髓基質(zhì)干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)，DPSCs(北京泰盛生物科技有限公司提供，批號：S20200107)，劈開牙齒用牙周刮匙剝出牙髓組織，轉(zhuǎn)移到PBS的培養(yǎng)皿中進行清潔并將分離的組織切成小塊。移入50mL離心管中，加入5mL(37℃)預(yù)熱消化酶溶液，在37℃水浴中孵育60min。每10分鐘用渦流管徹底分解組織。孵育后，加入3mL完全培養(yǎng)基使消化酶失活，通70μm細(xì)胞濾網(wǎng)得到單個懸浮細(xì)胞，然后以1200rpm離心10min，用1mL完全培養(yǎng)基復(fù)懸細(xì)胞。用10μL 0.4%臺盼藍(lán)細(xì)胞染色液稀釋10μL細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計數(shù)儀測定細(xì)胞濃度及活力。將3×106的細(xì)胞接入150mm培養(yǎng)皿中3h，然后用PBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿三次，去除未附著的細(xì)胞。將10mL新鮮完全培養(yǎng)基放入培養(yǎng)基中，接種后7d更換完全培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)7d。接種細(xì)胞后約10～14d，細(xì)胞生長為一個小簇并形成菌落。DPSCs傳代培養(yǎng)：用3mL PBS洗滌體外擴增的原代培養(yǎng)細(xì)胞兩次，并添加5mL胰蛋白酶/EDTA溶液以在150mm培養(yǎng)皿中在37℃下消化細(xì)胞3min。取5mL完全培養(yǎng)基滅活胰蛋白酶/EDTA溶液，移液至50mL離心管中，以1200rpm離心7min，吸取上清液，用完全培養(yǎng)基復(fù)懸。然后按上述方法計數(shù)細(xì)胞數(shù)，將3×106個細(xì)胞接種入150 mm培養(yǎng)皿，進一步擴增。待2～3d后，細(xì)胞融合度至80%～90%時進行傳代。細(xì)胞培養(yǎng)至第六代，制備成單細(xì)胞懸液，備用。所用干細(xì)胞已經(jīng)過細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定證明為間充質(zhì)干細(xì)胞；醋酸潑尼松龍：浙江仙琚制藥股份有限公司 (批號181003)；小動物稱量稱：中國凱豐集團有限公司KFS-C1；小動物剃毛器：寧波愛克利浦電器有限公司；3%戊巴比妥鈉：Amresco；醋酸潑尼松龍：浙江仙琚制藥股份有限公司 (批號181003)75%醫(yī)用酒精武漢市活力消毒用品有限公司；活力碘：武漢市活力消毒用品有限公司；帶線縫合針：上海金環(huán)；一次性使用無菌注射器：上?？档氯R企業(yè)發(fā)展集團股份有限公司；顱骨鉆：STR204；寵物X光機：江蘇康派醫(yī)療寵物X光機；Micro-CT檢測儀： 型號Skyscan1174 X-Ray Microtomograph(比利時Bruker公司)。

1.2分組:共采用健康成年日本大耳兔共47只，隨機分為4組：A組(正常對照組)，5只，同期飼養(yǎng)不做處理；B組(模型組)，14只，右側(cè)建立股骨頭壞死模型后不進行治療；C組(靜脈注入DPSCs)，14只，右側(cè)建立股骨頭壞死模型后，給予靜脈應(yīng)用干細(xì)胞；D組(隧道注入DPSCs)，14只，右側(cè)建立股骨頭壞死模型后，減壓隧道內(nèi)注入牙髓干細(xì)胞。造模鑒定后剩下35只，A組5只，B、C、D組各10只。

1.3實驗方法

1.3.1日本大耳兔股骨頭壞死模型的制備:將健康雄性日本大耳兔47只，全部適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，記為實驗開始時間(Day 0)。采用Miyanishi法[3]，B、C、D組右側(cè)臀部肌注醋酸潑尼松龍8mg/kg，每周2次，連續(xù)注射6周，A組為空白對照組，于右側(cè)臀部肌注等量生理鹽水，每周2次，連續(xù)注射6周。同時，所有實驗動物在左側(cè)臀肌給予預(yù)防性應(yīng)用青霉素8萬單位/kg，預(yù)防感染，每周2次，連續(xù)注射6周。

1.3.2模型的鑒定:激素注射6周后(Day 42)，建模完畢，從B、C、D組各隨機抽取4只氣栓處壞死并進行造模鑒定：取右側(cè)股骨頭組織行病理染色(HE染色)，光鏡下觀察骨小梁、骨細(xì)胞、髓腔及造血細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化，鑒定造模是否成功。骨小梁空骨陷窩、骨細(xì)胞核固縮、周圍骨髓壞死、脂肪細(xì)胞和造血細(xì)胞壞死均為骨壞死(骨小梁正常而僅有骨髓壞死也被認(rèn)為是骨壞死)。確定造模成功后進行下一步實驗。

1.3.3干預(yù)方法及給藥途徑:將經(jīng)過鑒定建模成功的B、C、D四組共30只大耳兔，每組10只，按不同分組分別給予相應(yīng)處理：B組，不進行任何處理；C組，給予兔耳緣靜脈注射DPSCs；D組，給予髓芯減壓+ DPSCs移植。髓芯減壓：3%戊巴比妥1mL/Kg行耳緣靜脈注射麻醉，至麻醉后3～5min，剔除大轉(zhuǎn)子部位毛發(fā)。俯臥位固定兔，充分暴露術(shù)區(qū)，消毒后以大轉(zhuǎn)子下2～3cm為中心沿股骨方向做1.5cm切口，顯露股骨粗隆，以環(huán)鉆朝向股骨頭方向，與股骨干成約70度角緩慢、間斷鉆孔，在X線透視監(jiān)視下，保證隧道經(jīng)過股骨頸到達股骨頭并不穿出股骨頭，隧道直徑2mm，鉆孔后用導(dǎo)針抽吸減壓。干細(xì)胞治療：于手術(shù)后即刻、手術(shù)后1周，術(shù)后2周共給予3次藥物注射：髓芯減壓后(Day 42)，D組動物給予隧道內(nèi)注入DPSCs 3×106細(xì)胞/只和等體積生理鹽水，注射完畢后以骨蠟封閉隧道，以縫線在骨膜上縫合標(biāo)記隧道口后縫合皮膚，無菌輔料包扎。于第一次注射后1周(Day 49)、2周(Day 56)再給予同樣處理，第2、3次局部注射時，需對動物進行靜脈麻醉，麻醉后以手按壓皮下縫線確定減壓孔，必要時行小切口，將藥物或生理鹽水注射進減壓隧道。C組直接給予耳緣靜脈注射DPSCs 3×106細(xì)胞/只。

1.4主要實驗指標(biāo)的采集

1.4.1X線檢查:最后一次治療結(jié)束后2周(Day 70)、6周(Day 98 處死前)行雙側(cè)股骨X線檢查，觀察正常側(cè)、造模側(cè)骨密度情況。于實驗開始后14周末(Day 98)處死動物進行終末檢測。

1.4.2大體形態(tài)觀察:處死動物后即可取材觀察股骨頭、關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)及色澤等，拍攝股骨大體照，隨即置于固定液中保存。

1.4.3Micro CT檢查:取右側(cè)股骨頭樣本行Micro CT檢測，電壓50kV，電流800μA，以26.8μm掃描分辨率、1304×1024視野大小對兔股骨頭進行掃描。將股骨軟骨下骨連續(xù)150張切片，即厚度為4mm區(qū)域內(nèi)的骨小梁設(shè)定為三維重建興趣區(qū)域 (ROI)，用N-Recon軟件進行三維圖像重建，用CT-AN軟件進行三維分析，區(qū)域骨密度(BMD)測定。獲得檢測指標(biāo)有：骨體積分?jǐn)?shù)BV/TV(%)、骨小梁厚度Tb.Th(mm)、骨小梁數(shù)量Tb.N(1/mm)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)SMI 、骨密度BMD(g/cm3)。在骨分解代謝大于骨合成代謝情況下，如發(fā)生骨質(zhì)疏松時，Tb.N和Tb.Th數(shù)值減少。

1.4.4病理學(xué)檢測:于CT檢查后進行，股骨頭標(biāo)本采用 4%多聚甲醛液固定，5%硝酸脫鈣，冠狀面剖開取材，常規(guī)乙醇梯度脫水，石蠟包埋切片，染色后進行鏡下檢測。檢測指標(biāo)有：大體觀察(骨小梁、骨細(xì)胞、髓腔及造血細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和數(shù)量的變化情況，鑒定造模是否成功)；空骨陷窩率：HE染色后，每張切片在400倍視野下進行拍照選骨組織，任選6個視野，拍照時盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致，骨小梁區(qū)域無細(xì)胞核的骨組織陷窩為空骨陷窩，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件以400倍標(biāo)尺為標(biāo)準(zhǔn)，對每張照片的空骨陷窩與總的骨陷窩進行計數(shù)，每個視野計數(shù)50個骨陷窩，并對同一骨小梁區(qū)的空骨陷窩進行計數(shù)，空骨陷窩率=空骨陷窩數(shù)量/總的骨陷窩數(shù)量。骨小梁面積占比：對目的區(qū)域進100倍成像，盡量讓組織充滿整個視野，保證每張照片的背景光一致，成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，統(tǒng)一以單位像素Pixel作為標(biāo)準(zhǔn)單位，分別測量每張圖片中的骨小梁像素面積記做A；測量每張圖片的視野像素面積記做B，計算出骨小梁面積占比=A/B×100%，記做C。

1.4.5免疫組化檢測:對兔血清中 VEGF的影響：血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有促內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促血管生成的作用。在激素引起的股骨頭壞死模型中，VEGF表達量應(yīng)顯著減少，導(dǎo)致血管修復(fù)能力下降，影響股骨頭局部病變血管的再生和修復(fù)，進一步加重骨壞死。另有文獻報道，VEGF具有增強成骨細(xì)胞BMP-2表達的作用。與模型組相比，各兩治療組血清中VEGF的含量均有所上升，干細(xì)胞移植組上升顯著，靜脈組VEGF小于移植組，差異有顯著性意義(P<0.05) 。結(jié)果見表 2。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 :所有35只實驗動物均無死亡，B、C、D組實驗動物注射醋酸潑尼松龍3～4周時，可觀察到右側(cè)后肢較對側(cè)瘦小、2只可見跛行，活動及反應(yīng)性普遍較對照組差，攝食量較前減少；干細(xì)胞移植組(D組)在手術(shù)減壓后1周內(nèi)活動減少，攝食量減少，至3周時逐漸恢復(fù)接近正常；靜脈給藥組(C組)于注射醋酸潑尼松龍后1周內(nèi)活動減少，攝食量減少，術(shù)后2～3周逐漸恢復(fù)至接近正常狀態(tài)。

2.2X線檢查:四組實驗動物行于髖部X線檢查治療結(jié)束后2周(Day 70)、6周(Day 98 處死前)行雙側(cè)股骨X線檢查， B組可觀察到股骨頭部位骨密度較A組有所減低，其余除實驗動物組部分可隱約觀察到手術(shù)減壓的釘?shù)劳?，外形未觀察到明顯異常(圖1)。

圖1 髖部X線片

2.3Micro-CT檢查:于處死動物后(Day 98)即刻取右股骨頭樣本行Micro-CT檢查，四組動物股骨頭外形均大致正常，未見明顯塌陷、形變等改變；與A組對比，B組樣本的骨小梁明顯排列稀疏，無規(guī)則，隧道周圍未見明顯新生骨質(zhì)生長；C、D兩組骨小梁排列較為規(guī)則、致密，隧道處均有新生骨長入，釘?shù)琅c周圍骨質(zhì)分界模糊，其中D組骨質(zhì)與正常對照組較為接近，C組略遜于D組(圖2)?；贑T影像數(shù)據(jù)用N-Recon軟件進行三維圖像重建，用CT-AN軟件進行三維分析，獲得檢測指標(biāo)有： BV/TV(%)、Tb.Th、Tb.N、SMI 、BMD。見表1、圖3。并對所得數(shù)據(jù)均數(shù)進行組件比較，采用方差分析法，P<0.05代表差異具有顯著性。模型組與對照組相比，所有指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)差異；靜脈給藥組和干細(xì)胞移植組分別與模型組比較，除Tb.N外，其余各指標(biāo)差異均具有顯著性，說明兩種給藥途徑均有效改善壞死部位骨質(zhì)情況，但是從數(shù)值上看，干細(xì)胞移植組改善更加明顯。

表1 各組Micro-CT指標(biāo)結(jié)果

圖2 兔股骨頭Micro-CT結(jié)果

圖3 各Micro-CT指標(biāo)條形圖

2.4病理學(xué)檢查:模型組與對照組相比，空泡陷窩率和骨小梁面積比均有顯著性差異(P<0.05)，靜脈給藥組和干細(xì)胞移植組分別與模型組比較，差異均具有顯著性(P<0.05)。從數(shù)值上看，干細(xì)胞移植組的療效優(yōu)于靜脈給藥組，結(jié)果與CT測量值相同(圖4、5、6)，見表2。

圖4 各組兔股骨頭組織切片(HE-400)

圖5 各組兔股骨頭組織切片(HE-100)

圖6 各組空泡陷窩率和骨小梁面積比條圖

表2 14周時各組骨小梁面積比(HE×100)和空骨陷窩率(HE×400)

2.5免疫組化檢測:模型組與對照組相比，VEGF明顯減低，差異具有顯著性(P<0.05)，靜脈給藥組和干細(xì)胞移植組分別與模型組比較，VEGF均顯著性上升，差異均具有顯著性(P<0.05)。兩治療組比較，干細(xì)胞移植組較靜脈給藥組上升顯著，差異有顯著性意義(P<0.05)?？梢娋植扛杉?xì)胞移植的方法可顯著誘導(dǎo)病變局部VEGF的產(chǎn)生，后者對壞死骨組織的再生及修復(fù)有積極作用。結(jié)果見表3、圖7。

表3 各組對兔血清中 VEGF的影響

圖7 各組VEGF條圖

3 討 論

股骨頭壞死的原因眾多，其病理基礎(chǔ)是股骨頭局部微血管損傷或血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致骨細(xì)胞或骨髓成分的死亡、脂肪變性，進而造成骨小梁斷裂和股骨頭塌陷，最終使髖關(guān)節(jié)功能喪失，故也稱為缺血性股骨頭壞死(avascular necrosis of the femoral head，ANFH)[4]。盡管其病因尚未完全明了但創(chuàng)傷、乙醇及糖皮質(zhì)激素已經(jīng)是較為明確的致病因素。病變的股骨頭骨質(zhì)中，紅骨髓轉(zhuǎn)變?yōu)橹竟撬?，從而使受累區(qū)域骨細(xì)胞總數(shù)減少。一旦發(fā)生股骨頭的塌陷或關(guān)節(jié)軟骨破壞，或繼發(fā)髖關(guān)節(jié)炎，其病理改變將是不可逆的，此時髖關(guān)節(jié)置換術(shù)可能是最適合也是唯一能采取的有效治療手段[5]。但是隨著人工關(guān)節(jié)的磨損、假體周圍骨折、感染等并發(fā)癥的出現(xiàn)，導(dǎo)致年輕患者或是預(yù)期壽命較長，術(shù)后生活質(zhì)量較高患者不可避免的會經(jīng)歷第二次甚至多次的翻修手術(shù)，加重了患者的身體及經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此及時發(fā)現(xiàn)早期ONFH并采取有效的保髖治療，延緩或避免髖關(guān)節(jié)置換是臨床治療早期ONFH應(yīng)追求的目標(biāo)。目前針對早期ONFH的保髖治療方法主要有：髓芯減壓術(shù)，相應(yīng)的截骨手術(shù)，帶或不帶血管蒂的植骨術(shù)等[6]。

這些手術(shù)清除病灶的同時降低了股骨頭內(nèi)壓，有利于新生血管的修復(fù)及新骨的形成，如果植骨還會增加對壞死區(qū)域的支撐，減緩股骨頭塌陷的發(fā)生。但是壞死區(qū)域骨質(zhì)修復(fù)時間長，強度差等問題還未有效解決。

間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells, MSCs) 是一種具有自我增殖潛能的細(xì)胞群體，在機體發(fā)育、疾病發(fā)展及治療中起到重要作用。股骨頭壞死時，在股骨頭、股骨頸部位發(fā)生大量的骨細(xì)胞凋亡，同時成骨細(xì)胞數(shù)量減少，活力降低。MSCs可提供成骨細(xì)胞或骨祖細(xì)胞，當(dāng)其到達股骨頭時，可定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞，理論上和修復(fù)骨質(zhì)破壞區(qū)。而髓芯減壓術(shù)提供了直達股骨壞死患處的隧道，因此，將MSCs通過髓芯減壓隧道直接注射到股骨頭壞死區(qū)，結(jié)合了二者的優(yōu)勢。有報道稱髓芯減壓術(shù)聯(lián)合干細(xì)胞移植，術(shù)后隨訪70%患者未發(fā)生進展，認(rèn)為MSCs可有效減緩股骨頭壞死的進展[7]。可用于ONFH的干細(xì)胞包括：間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs) 脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cell,ADSCs)，臍血干細(xì)胞(cord blood stem cell, CASCs)和外周血干細(xì)胞(peripheral blood stem cell ，PBSC)。最常用的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)。牙髓干細(xì)胞(DPSC)作為源最為廣泛的自體成體干細(xì)胞之一被應(yīng)用于組織工程中，同樣可通過誘導(dǎo)分化為軟骨、成骨、神經(jīng)等各種組織，日益收到研究者關(guān)注[8]。其具有多向分化、高度增殖、免疫調(diào)節(jié)、分泌細(xì)胞活性因子等生物學(xué)特性[9]。本實驗將DPSC應(yīng)用于ONFH的實驗研究當(dāng)中，是一種新的治療方法。

MSCs 移植治療 ONFH的給藥方式有多種選擇，可以靜脈注射，應(yīng)用較多的是干細(xì)胞移植，其中干細(xì)胞移植主要有：動脈介入法，髓芯減壓后通道灌注，復(fù)合支架材料植入等。但動脈介入法需要相應(yīng)的接入設(shè)備，專門的介入科醫(yī)生，對技術(shù)操作要求較高，于骨科開展有一定困難。復(fù)合支架材料植入法將制備好的干細(xì)胞以支架為載體植入病灶，有臨床研究表明取得良好療效，但其制備耗時長，操作成本高，且有損傷干細(xì)胞分化潛能的可能。靜脈注射干細(xì)胞操作簡單，成本低，不對患者造成額外的創(chuàng)傷，在臨床上更易推廣，通過本實驗研究顯示，靜脈注射干細(xì)胞組與干細(xì)胞移植組均對治療兔股骨頭壞死有顯著治療效果，從各項指標(biāo)上看，干細(xì)胞移植組的療效優(yōu)于靜脈注射組的。靜脈注射干細(xì)胞可作為其他治療方式的輔助治療方法活早期輕度股骨頭壞死病人的治療方式的選擇。本實驗是基于動物實驗得出的結(jié)論，可為今后進一步的臨床試驗提供數(shù)據(jù)支持。