circ_DONSON靶向miR-671-5p影響肺癌細胞放射敏感性的實驗研究

覃 波， 陸 錄， 趙 濤

(湖北省利川市人民醫院腫瘤科， 湖北 利川 445400)

肺癌是全球發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，多數患者確診時已處于中晚期，失去最佳手術治療時期[1]。放療是晚期肺癌治療的主要手段，然而，肺癌細胞對放射線產生的抗性(即放療抵抗)常導致放療效果不佳[2]，因此，增強肺癌細胞的放射敏感性對于提高放療療效、改善患者預后尤為重要。環狀RNA(circular RNA，circRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)是真核生物中廣泛存在的兩類非編碼RNA，且circRNA可與miRNA靶向結合，調控miRNA靶基因的表達，進而發揮生物學調控作用，在腫瘤的發生發展及放療抵抗中起重要調控作用[3～5]。研究顯示，circ_DONSON在神經膠質瘤和胃癌中的表達均明顯增加，其發揮促癌基因作用促進腫瘤細胞惡性表型，是神經膠質瘤和胃癌治療的潛在分子靶點[6,7]。然而，circ_DONSON對肺癌發生發展和放療抵抗的影響還未知。Starbase靶基因在線軟件預測顯示，circ_DONSON可能與miR-671-5p存在靶向調控關系。據報道，miR-671-5p的過表達可通過靶向抑制小腦變性相關蛋白1阻礙肺癌細胞遷移和侵襲[8]。本研究主要探究了circ_DONSON和miR-671-5p對肺癌細胞放射敏感性的影響及circ_DONSON能否靶向miR-671-5p發揮作用，以期為改善肺癌放療抵抗提供分子靶點。

1 資料與方法

1.1臨床資料:收集于2018年5月至2020年10月于本院行手術治療的43例肺癌患者的癌組織及癌旁組織，液氮保存，其中男性25例，女性18例，平均年齡(57.26±7.21)歲。納入標準：首次確診；術前未行放療、化療等治療。排除標準：合并其他惡性腫瘤患者。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則。

1.2細胞和試劑:A549細胞系，中國科學院上海細胞庫；RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物；RPMI 1640培養基、細胞計數試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、雙熒光素酶活性檢測試劑盒、LipofectamineTM 2000試劑盒、二喹啉甲酸蛋白檢測試劑盒和膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清，美國Hycolne公司；引物序列、circ_DONSON小干擾RNA(si-circ_DONSON)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-671-5p模擬物(mimcs)、模擬對照序列(miR-NC)、miR-671-5p抑制劑(inhibitor)，上海生工；兔抗人活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase3)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體及山羊抗兔二抗，中國Abcam公司。

1.3方 法

1.3.1實時定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測circ_DONSON和miR-671-5p表達在液氮保護下將收集的組織樣本充分研磨，用RNA抽提試劑盒提取組織樣本中總RNA，逆轉錄為cDNA后，行PCR擴增。引物序列：circ_DONSON上游5'-GTCGACTAGCGGCTCGACCGC-3'，下游5'-CGATAGGCGCTGCCTAGCCG-3'；GAPDH上游5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'；miR-671-5p上游5'-AGGAAGCCCTGGAGG-3'，下游5'-GAACATGTCTGCGTATCTC-3'；U6上游5'-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3'，下游5'-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3'。2-△△Ct法計算circ_DONSON相對GAPDH、miR-671-5p相對U6的表達量。

1.3.2細胞培養和照射處理:用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液(完全培養液)培養A549細胞。將對數期A549細胞接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養12h后，一次性給予2Gy、4GyX-ray照射[5]，劑量率為1.907Gy/min，源板距50cm。照射后，培養24h，收集細胞，用RT-qPCR法檢測細胞中circ_DONSON和miR-671-5p表達，方法同1.3.1。同時設置對照組，細胞常規培養，不進行照射處理。

1.3.3細胞轉染:將對數期A549細胞接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養24h后，棄培養液，加不含FBS的RPMI 1640培養液。然后用LipofectamineTM 2000脂質體法，分別轉染si-circ_DONSON、si-NC、miR-671-5p mimic、miR-NC、共轉染si-circ_DONSON與miR-671-5p inhibitor(si-circ_DONSON+miR-671-5p inhibitor)。轉染6h后，棄培養液，加完全培養液。再培養24h，RT-qPCR法檢測細胞中circ_DONSON或miR-671-5p表達驗證轉染效果，方法同1.3.1。

1.3.4CCK-8法檢測細胞增殖活性:將未轉染的A549細胞(對照組)、轉染si-circ_DONSON、si-NC、miR-671-5p mimic、miR-NC、si-circ_DONSON+miR-671-5p inhibitor的A549細胞均接種至96孔板中(5.0×104個/孔)，培養12h后，均一次性給予4Gy X-ray照射，照射條件同1.3.2。照射后，再培養24h。加10μL CCK-8，孵育2h后，酶標儀(450nm)測光密度(optical density，OD)值。OD值越大，說明細胞增殖活性越強。

1.3.5克隆形成實驗檢測細胞集落形成:將未轉染的A549細胞(對照組)、轉染si-circ_DONSON、si-NC、miR-671-5p mimic、miR-NC、si-circ_DONSON+miR-671-5p inhibitor的A549細胞均接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養12h后，均一次性給予4Gy X-ray照射，照射條件同1.3.2。照射后，繼續培養10～14d。當出現肉眼可見的集落時，棄培養液。用4%多聚甲醛固定30min，0.4%結晶紫染色15min，顯微鏡觀察，統計集落形成數。

1.3.6流式細胞術檢測細胞凋亡:細胞接種及照射處理同1.3.5。照射后，繼續培養24h。棄培養液，收集各組細胞。利用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡。

1.3.7蛋白質印跡法檢測細胞中Cleaved-caspase3表達:細胞接種及照射處理同1.3.5。照射后，繼續培養24h。然后棄培養液，收集各組細胞。用RIPA試劑提取細胞中總蛋白，經二喹啉甲酸試劑盒測蛋白濃度后進行電泳分離。然后將分離蛋白進行轉膜和封閉處理后，在4℃冰箱中分別用Cleaved-caspase3(1∶500)和GAPDH(1∶1000)一抗孵育過夜。洗膜后，再于37℃搖床中用山羊抗兔二抗(1∶1000)孵育2h。加顯影液，避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析Cleaved-caspase3相對GAPDH的表達量。

1.3.8雙熒光素酶報告基因實驗:由上海生工生物工程有限公司采用PCR技術擴增含miR-671-5p結合位點的circ_DONSON核苷酸序列，插入pGL3空載體，構建circ_DONSON野生型熒光素酶報告基因載體(WT-circ_DONSON)；同時將結合位點突變后進行擴增，插入pGL3空載體，構建circ_DONSON突變型熒光素酶報告基因載體(MUT-circ_DONSON)。將對數期A549細胞接種至6孔板中(1.0×105個/孔)，培養24h后，棄培養液。加不含FBS的RPMI 1640培養液。用LipofectamineTM 2000脂質體法，分別共轉染WT-circ_DONSON與miR-671-5p mimic或miR-NC、MUT-circ_DONSON與miR-671-5p mimic或miR-NC。轉染6 h后，更換為完全培養液。再培養24 h，裂解細胞。離心(3500 r/min、5 min)，取上清液，檢測熒光素酶活性，結果以螢火蟲與海腎的熒光強度比值表示。

2 結 果

2.1circ_DONSON和miR-671-5p在肺癌組織中的表達及其與患者臨床指標之間的關系分析:肺癌組織中circ_DONSON的表達量為4.27±0.38，高于癌旁組織中circ_DONSON的表達量(0.80±0.13，t=56.656，P<0.05)；而miR-671-5p的表達量為0.37±0.07，低于癌旁組織中miR-671-5p的表達量(0.37±0.07，t=34.457，P<0.05)。見圖1。

圖1 肺癌組織中circ_DONSON和miR-671-5p的表達

2.2X-ray對肺癌細胞A549中circ_DONSON和miR-671-5p表達的影響:與對照組肺癌細胞A549比較，A549細胞經劑量(2Gy、4Gy) X-ray照射后，細胞中circ_DONSON表達升高(P<0.05)，而miR-671-5p表達降低(P<0.05)。見表1。

表1 X-ray對肺癌細胞A549中circ_DONSON和miR-671-5p表達的影響

2.3沉默circ_DONSON對肺癌細胞增殖凋亡的影響:對照組、轉染si-NC、si-circ_DONSON的肺癌細胞A549中circ_DONSON表達分別為1.00±0.00、0.99±0.04、0.16±0.01，三組比較差異具有統計學意義(F=1230.529，P<0.05)。轉染si-circ_DONSON的A549細胞中circ_DONSON表達顯著低于對照組和轉染si-NC的A549細胞(P<0.05)，表明沉默circ_DONSON的A549細胞構建成功。與對照組和轉染si-NC的A549細胞比較，轉染si-circ_DONSON的A549細胞經4Gy X-ray照射后，細胞增殖活性和集落形成數降低(P<0.05)，而細胞凋亡率和細胞中Cleaved-caspase3蛋白表達均升高(P<0.05)。見圖2、表2。

表2 沉默circ_DONSON對X-ray處理的肺癌細胞增殖和凋亡的影響

圖2 沉默circ_DONSON對X-ray處理的肺癌細胞集落形成和凋亡的影響

2.4沉默circ_DONSON靶向調控miR-671-5p:Starbase靶基因在線軟件預測顯示的circ_DONSON與miR-671-5p的結合位點見圖3。共轉染WT-circ_DONSON與miR-671-5p mimic的肺癌細胞A549熒光素酶活性為0.28±0.02，明顯低于共轉染WT-circ_DONSON與miR-NC的A549細胞熒光素酶活性1.00±0.09(t=13.526，P<0.05)；共轉染MUT-circ_DONSON與miR-671-5p mimic的A549細胞熒光素酶活性為0.99±0.07，與共轉染MUT-circ_DONSON與miR-NC的A549細胞熒光素酶活性1.02±0.11比較無顯著差異(P>0.05)，說明circ_DONSON可靶向結合miR-671-5p。同時，轉染si-circ_DONSON的A549細胞中miR-671-5p表達為4.66±0.21，明顯高于轉染si-NC的細胞中miR-671-5p的表達1.00±0.02(t=30.051，P<0.05)，說明沉默circ_DONSON促進A549細胞中miR-671-5p表達。

圖3 circ_DONSON與miR-671-5p的互補序列

2.5過表達miR-671-5p對X-ray處理的肺癌細胞增殖和凋亡的影響:對照組、轉染miR-NC、miR-671-5p mimic的肺癌細胞A549中miR-671-5p表達分別為1.00±0.00、0.98±0.09、4.01±0.21，三組比較差異具有統計學意義(F=524.178，P<0.05)。轉染miR-671-5p mimic的A549細胞中miR-671-5p表達顯著高于對照組和轉染miR-NC的A549細胞(P<0.05)，表明過表達miR-671-5p的A549細胞構建成功。與對照組和轉染miR-NC的A549細胞比較，轉染miR-671-5p的A549細胞經4Gy X-ray照射后，細胞增殖活性和集落形成數降低(P<0.05)，而細胞凋亡率和細胞中Cleaved-caspase3蛋白表達均升高(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 過表達miR-671-5p對X-ray處理的肺癌細胞集落形成和凋亡的影響

表3 過表達miR-671-5p對X-ray處理的肺癌細胞增殖和凋亡的影響

2.6抑制miR-671-5p降低沉默circ_DONSON對X-ray處理的肺癌細胞增殖和凋亡的影響:對照組、轉染si-circ_DONSON、共轉染si-circ_DONSON與miR-671-5p inhibitor的肺癌細胞A549中miR-671-5p表達分別為1.00±0.00、4.63±0.23、1.26±0.09，三組比較差異具有統計學意義(F=604.953，P<0.05)。共轉染si-circ_DONSON與miR-671-5p inhibitor的A549細胞中miR-671-5p表達顯著低于對照組和轉染si-circ_DONSON的A549細胞(P<0.05)，表明A549細胞中miR-671-5p表達受到抑制。與轉染si-circ_DONSON的A549細胞比較，共轉染si-circ_DONSON與miR-671-5p inhibitor的A549細胞經4 Gy X-ray照射后，細胞增殖活性和集落形成數升高(P<0.05)，而細胞凋亡率和細胞中Cleaved-caspase3蛋白表達均降低(P<0.05)。見圖5、表4。

表4 抑制miR-671-5p降低沉默circ_DONSON對X-ray處理的肺癌細胞增殖和凋亡的影響

圖5 抑制miR-671-5p降低沉默circ_DONSON對X-ray處理的肺癌細胞集落形成和凋亡的影響

3 討 論

肺癌的發生發展及放療抵抗與原癌基因的激活及抑癌基因的失活密切相關，探究肺癌中異常表達的基因分子及其對肺癌生發展和放療抵抗的影響，可為肺癌發病機制的闡明及治療靶點的選擇提供新途徑。circRNA呈閉合環狀，穩定性較強，且高度保守。當前研究顯示，肺癌中存在大量異常表達的circRNA，這些circRNA可通過發揮miRNA分子海綿作用，調控miRNA靶基因的表達，進而影響肺癌細胞的惡性表型及放射敏感性，對肺癌發生發展及治療效果起調控作用[9,10]。研究顯示，下調circ_0086720可通過調節miR-375/SPIN1軸增強了肺癌細胞對放射線的敏感性，circ_0086720有可能成為改善肺癌放射治療療效的分子靶點[11]；circPVT1沉默的肺癌細胞進放射線處理后其增殖和侵襲能力降低，說明了沉默circPVT1可促進肺癌細胞對放射線的敏感性[12]。circ_DONSON是近年來新發現的一種circRNA，其對肺癌放射敏感的影響還未知。

本研究結果顯示，肺癌組織中circ_DONSON的表達高于癌旁組織，提示circ_DONSON可能促進肺癌發展進程；將肺癌細胞置于放射線下照射后，細胞中circ_DONSON的表達增加，而沉默circ_DONSON可降低放射線照射的A549細胞增殖活性和集落形成數，并提高細胞凋亡率，這表明沉默circ_DONSON可增強A549細胞對放射線的敏感性，circ_DONSON有可能成為改善肺癌放療抵抗的分子靶點。細胞凋亡受多種基因分子的調控，其中caspase級聯反應在細胞凋亡中起關鍵調控作用。caspase3是caspase級聯反應的核心分子，其在受到上游凋亡信號刺激后被活化后生成Cleaved-caspase3，進一步剪切各種細胞底物，誘導細胞凋亡[13]。本研究結果顯示，沉默circ_DONSON可促進放射線處理的肺癌細胞中caspase3的活化，提示其可能通過調控caspase級聯反應來影響肺癌細胞凋亡，進而影響肺癌細胞放射敏感性。

為了進一步探究沉默circ_DONSON增強肺癌細胞A549放射敏感性的分子機制，本研究證實了circ_DONSON可靶向結合并負調控miR-671-5p。miR-671-5p參與多種腫瘤的發展進程。研究顯示，桂枝茯苓丸可通過上調miR-671-5p的表達削弱人皮膚惡性黑色素瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力，具有治療黑色素瘤的潛在價值[14]；骨肉瘤組織和細胞系中miR-671-5p表達下調，過表達MiR-671-5p了通過靶向抑制釉叢蛋白1(tuftelin 1，TUFT1)的表達阻止骨肉瘤細胞生長、遷移和侵襲，miR-671-5p/TUFT1軸可能為骨肉瘤的治療提供了新靶點[15]；miR-671-5p通過降低乳腺癌細胞的DNA修復能力增強其對紫外線和化療藥物的敏感性。本研究結果顯示，miR-671-5p在肺癌組織及放射線照射的肺癌細胞A549中表達減少，提示miR-671-5p有可能參與肺癌放射敏感性；進一步研究發現，放射線照射的過表達miR-671-5p的A549細胞增殖活性及集落形成數較未過表達miR-671-5p的A549細胞明顯降低，而凋亡率和細胞中Cleaved-caspase3蛋白表達明顯升高，提示過表達miR-671-5p可增強放射線照射對A549細胞增殖的抑制作用及凋亡促進作用，即過表達miR-671-5p增強了A549細胞的放射敏感性。此外，本研究還顯示，沉默miR-671-5p降低了沉默circ_DONSON對放射線照射的A549細胞增殖和凋亡的影響，提示circ_DONSON可能通過靶向抑制miR-671-5p表達來促進肺癌細胞放療抵抗。

綜上，放射線照射可引起肺癌細胞中circ_DONSON的表達增加，而miR-671-5p表達減少；沉默circ_DONSON可抑制放射線處理的肺癌細胞增殖，并促進其凋亡，增強肺癌細胞放射敏感性，其作用機制可能與靶向結合并負調控miR-671-5p表達有關。