高壓氧調控TLR4/NF-κB通路對膿毒癥大鼠海馬區細胞凋亡的影響

郭 慧， 李旭蕊， 曲珍珍， 李建國

(河北省人民醫院， 河北 石家莊 050051)

膿毒癥是重癥監護病房患者死亡的最常見原因之一，盡管最近的醫學進展大大提高了存活率，但膿毒癥相關性腦病(sepsis-associated encephalopathy，SAE)仍是一種嚴重的并發癥，發病率高達70%[1]。SAE通常表現出嚴重的、長期的認知障礙，不但影響生活質量，還增加了患者的死亡風險。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)/核因子(nuclear factor，NF)-κB通路是膿毒癥不受控制的炎性反應的主要機制，該通路可被脂多糖等激活，并最終促進白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-6的分泌，從而導致海馬神經元炎性損傷和凋亡[2]。高壓氧(hyperbaric oxygenation，HBO)是一種現代醫學手段，其可通過提高氧分壓使氧分子到達血紅蛋白無法穿透的組織，研究顯示HBO具有抗炎、抗氧化應激、調控免疫和調節細胞凋亡的作用[3]。近年來HBO在腦神經保護中有著廣泛的應用，研究顯示HBO能夠減少腦出血后繼發的神經元損傷，保護腦神經功能[4]。但是HBO對SAE的影響和機制仍不清楚。本文主要分析HBO干預通過調控TLR-4/NF-κB通路對SAE大鼠海馬區細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料:Sprague-Dawley(SD)大鼠(SPF級，雄性，7～8周，180～200g，北京維通利華動物公司，中國)。水迷宮視頻跟蹤分析系統(上海移數信息科技有限公司，中國)。HE和TUNEL凋亡試劑盒(Roche公司，美國)。四氧化鋨(Sigma公司，美國)。乙酸鈾酰和檸檬酸鉛(上海生工公司，中國)。樹脂(Epon812，TAAB公司，英國)。超薄切片機(LKB公司，瑞典)。RNAspin Mini試劑盒(GE Healthcare，美國)。Bestar qPCR RT和BestarTMqPCR試劑盒(DBI Bioscience公司，德國)。Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統(Santa公司，美國)。一抗和山羊抗兔HRP-IgG二抗(博士德公司，美國)。PVDF膜(Millipore公司，美國)。ECL顯色試劑盒(Thermo Fisher公司，美國)。光學顯微鏡(Olympus 公司，日本)。JEM-1230 透射電子顯微鏡(JEOL 公司，日本)。

1.2建模、分組和干預:將45只大鼠隨機分為對照組、SAE組和SAE+HBO組(n=15)。通過腹腔注射LPS構建SAE模型(15mg/kg，3d)。在建模前2d和建模后3d，每日接受HBO干預，大鼠放置于高壓氧艙中，在20min緩慢、穩定的加壓至2.2個絕對大氣壓力，然后再此壓力下呼吸95%的氧氣60min；吸氧結束后再20min內緩慢、穩定的降至常壓常氧，每日1次。

1.3觀察指標和檢測方法

1.3.1水迷宮實驗:通過水迷宮視頻跟蹤分析系統分析大鼠神經功能，通過檢測大鼠的逃避潛伏期和穿越平臺次數分析神經功能，逃避潛伏期越長、穿越平臺次數越低提示神經功能損傷越嚴重。

1.3.2ELISA:取大鼠尾靜脈血離心(3000rpm，20min，4℃)收集血清，通過ELISA檢測IL-1β和IL-6的水平。根據說明書加入抗體和顯色劑，根據450nm下的光密度和標準曲線計算濃度。

1.3.3HE染色:大鼠斷頭處死后取出海馬體組織并在室溫下用4%多聚甲醛固定6h。用乙醇脫水(從低濃度到高濃度)后，將組織包埋在石蠟中。然后將石蠟包埋的組織切成5μm的切片，并將切片固定在載玻片上。將載玻片在室溫下放入蘇木精中染色10min。用自來水洗滌1～2min后，將玻片置于10%冰醋酸中10s，然后置于1%氨水中，直到切片變藍。隨后用自來水清洗1～2min后，將玻片放入曙紅中10s。在乙醇(濃度分別為70%、90%、95%和100%)中脫水后，將玻片置于二甲苯中2min；重復此步驟一次。最后，用中性膠密封玻片。在倒置顯微鏡下觀察載玻片。

1.3.4TUENL染色:將海馬體組織樣本在流水下洗滌8h。樣本在洗滌后置于70%的乙醇中過夜。然后將組織塊分別浸入80%，90%，100%A和100%B乙醇中1h。然后使用丙酮，二甲苯A和二甲苯B分別浸泡30min，直到組織塊出現棕褐色或暗紅色并透明。將塊料分別放入水浴石蠟罐中1h(60℃)，并將塊放置在嵌入模具中并切成4μm的厚度。將切下的切片置于45℃的烘箱中過夜。經過脫蠟和修復抗原后，用10mM Tris-鹽酸(pH7.4～7.8)將蛋白酶K稀釋成10～20μg/mL的溶液，然后將蛋白酶K稀釋液逐滴加入樣品中，用膜覆蓋，并在37℃下孵育20min。然后將樣品用PBS洗滌兩次，每次5min。將制備的TUNEL反應混合物滴在載玻片上，用膜覆蓋，并在37℃下孵育60min。然后將其用PBS洗滌3次，每次5min。顯色后在×200倍數的顯微鏡下隨機選擇5個視野，計算TUNEL染色陽性的凋亡細胞。

1.3.5電子顯微鏡觀察神經元:將海馬體組織在室溫下浸入含有4%甲醛、2.5%戊二醛的、濃度為0.1M磷酸鈉緩沖液(pH=7.4)中浸泡2h。然后將組織使用2%的四氧化鋨固定。經過梯度酒精脫水后包埋在Epon 812樹脂混合物(TAAB，英國伯克斯)中。然后使用Leica EM UC6超薄切片機切割成超薄切片(約70nm)，分別使用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛雙重染色，并用電子顯微鏡觀察海馬神經元。

1.3.6RT-qPCR:使用RNeasy Mini試劑盒取海馬組織中的總RNA，然后使用Bestar qPCR RT試劑盒將其逆轉錄為cDNA，條件如下：37℃/15min；98℃/5min。然后使用BestarTMqPCR預混液進行qPCR實驗，條件如下：95℃/2min，94℃20s，58℃20s，72℃/20s，40個循環，最后在72℃下延伸4min。使用Agilent Stratagene Mx3000P序列檢測系統進行RT-qPCR分析。通過比較循環閾值并以GAPDH作為內參計算mRNA相對表達水平。

1.3.7Western blot:將海馬體組織在放射免疫沉淀測定裂解緩沖液中在冰上裂解。通過8%的SDS-PAGE分離每個樣品中等量(50μg)的蛋白質，并將其轉移到硝酸纖維素膜上。通過在室溫下將膜浸入5%脫脂牛奶中2h封閉非特異性抗原。隨后，將膜與一抗體在4℃下孵育過夜，然后將膜與相應的辣根過氧化物酶偶聯的二抗在室溫下孵育1h。使用化學發光試劑顯示，使用Quantum One軟件分析灰度計算蛋白相對于GAPDH的表達量。

2 結 果

2.1HBO對SAE大鼠神經功能的影響:三組大鼠水迷宮實驗結果比較差異顯著(P<0.05)。SAE組的逃避潛伏期(44.06±5.12s)顯著高于對照組，穿越平臺次數(2.94±0.35次)顯著低于對照組(P<0.05)。SAE+HBO組的逃避潛伏期(35.86±3.06s)顯著低于SAE組，穿越平臺次數(4.98±0.66次)顯著高于SAE組(P<0.05)，見表1。

表1 HBO對SAE大鼠水迷宮實驗結果的影響

2.2HBO對SAE大鼠炎性反應的影響:三組大鼠血清炎性因子水平比較差異顯著(P<0.05)。SAE組的IL-1β(76.25±8.06pg/mL)和IL-6(91.37±10.74pg/mL)水平顯著高于對照組(P<0.05)。SAE+HBO組的IL-1β(48.68±5.21pg/mL)和IL-6(64.47±7.06pg/mL)水平顯著低于SAE組(P<0.05)，見表2。

表2 HBO對SAE大鼠血清IL-1β和IL-6水平的影響

2.3HBO對SAE大鼠海馬組織損傷的影響:對照組海馬體神經元的形態正常，SAE組觀察到嚴重的神經元變性，發現了許多增色細胞，神經元細胞質收縮甚至出現空泡。SAE+HBO組海馬神經組織損傷情況較SAE組輕。見圖1。

圖1 HE染色檢測HBO對SAE大鼠海馬組織損傷的影響(×200)

2.4HBO對SAE大鼠海馬神經元凋亡的影響:如圖2所示，藍色進而棕色分別為細胞核和TUNEL陽性的凋亡細胞的細胞核。三組大鼠海馬神經元凋亡情況比較差異顯著(P<0.05)，SAE組的凋亡細胞(6.17±0.78個/視野)顯著高于對照組(P<0.05)，SAE+HBO組的的凋亡細胞(3.42±0.52個/視野)顯著低于SAE組(P<0.05)，見表3。

圖2 TUNEL染色檢測HBO對SAE大鼠海馬神經元凋亡的影響(×200)(黑色箭頭提示凋亡細胞)

表3 HBO對SAE大鼠海馬神經元凋亡的影響

2.5HBO對SAE大鼠海馬神經元損傷情況的影響:電鏡分析表明，對照組的腦毛細血管完整結構，鄰近的神經元結構正常。SAE組出現神經元腫脹和細胞膜破裂，同時還能觀察到神經元的細胞質密度增加，細胞器異常。SAE+HBO組的神經元損傷情況較SAE組輕。見圖3。

圖3 電子顯微鏡觀察HBO對SAE大鼠海馬神經元損傷情況的影響(bar=2μm)

2.6HBO對SAE大鼠海馬體組織中TLR4和NF-κB轉錄水平的影響:三組SAE大鼠海馬體組織中TLR4和NF-κB轉錄水平比較差異顯著(P<0.05)。SAE組的TLR4(5.82±0.54)和NF-κB(5.61±0.53)mRNA水平顯著高于對照組(P<0.05)，SAE+HBO組的TLR4(2.75±0.25)和NF-κB(3.02±0.29)mRNA水平顯著低于SAE組(P<0.05)，見表4。

表4 HBO對SAE大鼠海馬體組織中TLR4 mRNA和NF-κB mRNA水平的影響

2.7HBO對SAE大鼠海馬體組織中TLR4/NF-κB通路中蛋白表達水平的影響:三組SAE大鼠海馬體組織中TLR4/NF-κB通路中蛋白表達水平比較差異顯著(P<0.05)。SAE組的TLR4(3.79±0.34)和NF-κB(3.21±0.29)蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05)，SAE+HBO組的TLR4(1.05±0.09)和NF-κB(1.47±0.13)蛋白水平顯著低于SAE組(P<0.05)，見圖4和表5。

圖4 Western blot檢測HBO對SAE大鼠海馬體組織中TLR4/NF-κB通路中蛋白表達水平的影響

表5 HBO對SAE大鼠海馬體組織中TLR4和NF-κB蛋白表達水平的影響

3 討 論

SAE是由感染的全身反應引起的常見腦功能障礙，SAE患者表現出不同程度的認知功能障礙，這些認知障礙可能歸因于敗血癥本身，或歸因于敗血癥增加了大腦對神經退行性疾病的敏感性[5]。SAE可在出院后持續數月至數年，但是目前尚無有效的干預SAE的方法，SAE患者通常需要長期的康復干預治療才能恢復功能，尋找有效的治療SAE的方法具有重要的現實意義。

HBO是在加壓艙中進行的非侵入性療法，患者在高于正常大氣壓的情況下吸入純氧，這改善了從肺部到全身器官的氧合作用，特別是在缺血性狀況下。HBO療法目前用于治療急性和慢性缺血性損傷，包括與潛水有關的傷害、中風、脊髓損傷等[6]。研究顯示HBO可以促進神經功能的恢復，如Tan等[7]研究結果顯示脊髓損傷患者接受早期HBO治療可明顯提高體感誘發電位和運動誘發電位的峰值，縮短潛伏期，加快神經傳導，從而促進患者運動和自理能力的恢復。近年來，HBO在感染和炎性相關疾病的治療中也取得了重大進展，研究結果顯示HBO可以緩解脂多糖誘導的上皮細胞釋放炎性細胞因子和抑制凋亡[8]。本次研究通過HBO干預SAE模型小鼠，結果顯示HBO不但可以抑制炎性細胞因子的釋放保護神經功能，還明顯減少了海馬體神經元的損傷和凋亡。研究結果顯示海馬體神經元的凋亡是導致SAE患者記憶功能、神經損傷和運動功能受損的重要機制[9]。Ying等[10]研究結果也表明HBO干預可通過調控脊髓損傷大鼠中的BDNF/TrkB信號通路減少神經元凋亡和損傷。這提示HBO可顯著的抑制SAE大鼠海馬體神經元的損傷和凋亡，從而保護神經功能，但是其分子機制仍需要進一步研究。

研究認為TLR4在膿毒癥相關的炎性反應和細胞凋亡中發揮重要作用，TLR4可被脂多糖等激活，而TLR4蛋白可激活下游轉錄因子NF-κB進而調控免疫炎性基因的轉錄，從而導致細胞損傷和凋亡[11]。該通路也是SAE海馬體神經元損傷和凋亡的重要機制。而抑制TLR4/NF-κB可保護海馬神經元[12]。本次研究結果顯示SAE大鼠海馬體組織中TLR4和NF-κB轉錄和翻譯的水平均明顯升高，而HBO干預可顯著抑制TLR4/NF-κB通路。Liu等[13]認為HBO可通過抑制星形膠質細胞中的NF-κB信號通路減輕脂多糖引起的炎癥反應。HBO干預能夠通過抑制TLR4/NF-κB通路緩解大鼠實驗性蛛網膜下腔出血后的早期腦損傷[14]。也有研究顯示HBO可通過抑制TLR4/NF-κB介導炎癥而改善聽力喪失患者的聽力水平。這提示HBO保護SAE的功能可能與TLR4/NF-κB通路有關，HBO可能通過神經抑制TLR4和NF-κB的轉錄和翻譯，從而抑制海馬神經元損傷。

綜上所述，HBO可能通過抑制TLR4/NF-κB通路緩解SAE引起的海馬神經元損傷和凋亡，進而保護神經功能。但是關于HBO對SAE的治療效果仍需要臨床研究證實，并且其機制仍需要進一步的驗證。