蒺藜苜蓿lncRNA167及其剪切產物miR167c的鑒定和功能分析

張家駒，于潔，李明娜，康俊梅，楊青川，龍瑞才

（中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193）

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是存在于真核生物中的一類長度大于200 nt、無蛋白編碼能力或編碼能力很低的RNA轉錄本［1］。起初，lncRNA被認為是轉錄的“噪音分子”，由于它們表達水平低且位置保守，所以被認為是一種不具備生物學功能的副產物［2］。隨著高通量測序和生物信息學工具的發展，lncRNAs被證明廣泛存在，是構成真核生物轉錄組的重要成分。目前lncRNA的研究多集中于哺乳動物中，研究證明其錯誤表達會誘導細胞癌變，并增強癌細胞生長和轉移的能力［3］。lncRNA的作用機制和生物學功能復雜多樣，可與DNA、RNA、蛋白質分子等相互作用，在染色質、轉錄和轉錄后水平起著重要的調節作用。

根據其基因組來源和相對于鄰近蛋白編碼基因的位置，lncRNA可分為基因間lncRNA（long intergenic noncoding RNAs，lincRNAs）、基因內lncRNA（long intronic noncoding RNAs，incRNAs）以及天然反義轉錄本（long noncoding natural antisense transcripts，lncNATs）。在哺乳動物中，基因間lncRNA也被稱為大型介入性非編碼RNA（large intervening noncoding RNA，lincRNA）［4］。基因間lncRNA與編碼蛋白基因無任何重疊，基因內lncRNA既與編碼蛋白的基因位點重疊，又與內含子位點重疊。而天然反義轉錄本在基因互補鏈上與基因的部分外顯子序列互補［5］。這類lncRNA可以以順式或反式的方式調控植物的開花時間、基因沉默、根系器官形成、幼苗光形態形成和繁殖等［6—7］。mRNA在細胞核中產生，并被輸出到細胞質中翻譯成蛋白質，與mRNA不同的是，大多數lncRNA主要存在于細胞核中，有些可能只存在于細胞質中，也可能同時存在于兩個亞細胞室中［8］。相比于早先被大量研究的miRNA，lncRNA目前在植物中的研究還很少，只有很少一部分lncRNA被鑒定，研究前景廣闊。

近兩年來，大量的研究集中于非生物脅迫相關的lncRNA轉錄組測序，包括鹽［9］、低溫［10］、干旱［11］、營養缺乏［12］等。在鹽脅迫的研究中，Sun等［13］通過比較轉錄組測序，鑒定了甜高粱（Sorghum bicolor）中響應鹽脅迫的lncRNA，其中包括lncRNA 13472、lncRNA 11310、lncRNA 2846、lncRNA 26929和lncRNA 14798，它們可能是競爭性內源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNAs），通過調控離子轉運、蛋白修飾、轉錄調控和物質合成轉運等靶基因的表達，影響植物對鹽脅迫的響應。Wan等［14］通過綜合分析lncRNA與mRNA，揭示lncRNA對于茶樹（Camellia sinensis）耐鹽性的調控作用，鑒定了172條差異表達lncRNA，其中12條可能作為miRNA靶模擬物的lncRNA。Fu等［15］和Jannesar等［16］也利用轉錄組測序分別對黃蓮花（Pistacia vera）、浮萍（Lemna minor）兩種非模式植物中鹽響應lncRNA進行鑒定和功能分析。

miRNA是一種廣泛存在于高等動植物中的內源性非編碼RNA，成熟miRNA長度主要集中在20～24 nt的范圍內，在植物中以21或24 nt為主，而在動物中以22 nt為主。miRNA在植物中研究起步稍晚于動物，miRNA 167（miR167）是一個高度保守的miRNA家族，通過下調生長素響應因子6/8（auxin response factor 6/8，ARF6/8）的表達參與植物生長素信號傳導，在植物的各種發育過程中發揮關鍵作用［17—19］。除了ARF6/8外，miR167還可以靶向IAA-Ala Resistant3基因在發育和非生物脅迫中發揮關鍵作用［20］。目前，大部分miR167的研究集中于擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）和番茄（Lycopersicon esculentum）中。在擬南芥中，miR167調控ARF6/8控制胚珠和花藥的育性［21—22］，并且會抑制不定根的產生［23］。最新的研究發現，miR167的突變體開花時間會稍微晚于野生型植株［24］。在番茄中，過表達miR167a的植株葉片變小和節間長度縮短，花瓣、雄蕊和花柱縮短，同時也會引起雄性不育［25］。在水稻中，miR167會調控籽粒灌漿以及淀粉的積累［26—27］，且過表達miR167導致水稻分蘗角度變大和植株矮小［28］。在大豆（Glycine max）中，miR167調控生長素應答因子GmARF8a和GmARF8b參與大豆根瘤形成和側根發育［29］。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中，暫時沒有針對miR167功能的相關研究。

最新的研究表明，擬南芥中存在一種能夠被藍光誘導的lncRNA，其可以作為miR167的內源性目標擬態（endogenous target mimicry，eTM）參與擬南芥光形態的建成和對甘露醇的響應［30］。更早的研究中發現，毛白楊（Populustomentosa）中存在lncRNAARFRL-PtomiR167a-PtoARF8的互作關系，三者在毛白楊木質部的形成過程中發揮重要作用［31］。上述研究表明miR167與lncRNA可能存在互作關系，但均為lncRNA作為eTM抑制miRNA發揮作用，目前在植物中，還沒有可以作為miRNA前體的lncRNA被報道。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一種重要的豆科牧草。在實際生產中，土壤鹽漬化嚴重制約紫花苜蓿的產量。蒺藜苜蓿雖然飼用價值不高，但已成為繼大豆、百脈根（Lotuscorniculatus）之后的第3種豆科模式植物，常用于研究紫花苜蓿等苜蓿屬植物的相關基因分子機制。Wang等［32］和Zhao等［33］近年通過高通量測序，從蒺藜苜蓿中挖掘了一批鹽脅迫、低溫脅迫和磷元素缺失等非生物脅迫響應lncRNA。但目前為止，功能明確的lncRNA在蒺藜苜蓿中寥寥無幾。比如，MtENOD40可以通過蛋白的重定位參與調控蒺藜苜蓿根瘤的形成［34］，Mt4作為miR399的ceRNA調控其靶基因PHO2的表達，從而提高蒺藜苜蓿對磷缺乏環境的適應性［35］。上述兩個lncRNA均為20世紀末被發現，隨著高通量測序的快速發展，lncRNA在蒺藜苜蓿中被大量鑒定，但明確其功能和作用機制的lncRNA依然很少，該領域依然存在很大空白。為填補這一領域的空白，本研究通過轉錄組測序鑒定了一個鹽堿脅迫響應Mt-lncRNA 167，利用生物信息學分析了其編碼潛能及其與周圍基因間的位置關系，并預測其可能是miRNA 167家族的一個新成員miRNA 167c前體。利用生物信息學軟件分析了該lncRNA編碼的Mt-miR167c的二級結構、保守性以及靶基因，并檢測了Mt-lncRNA 167與Mt-miR167c以及靶基因在不同非生物脅迫處理下（NaCl、聚乙二醇、4℃）的表達水平。通過分析Mt-lncRNA 167與Mt-miR167c超表達擬南芥植株的表型及其表達量水平，初步驗證了二者的關系。本研究克隆鑒定一個全新的lncRNA和一個蒺藜苜蓿miR167家族新成員，并初步揭示了二者之間的互作關系，為后續耐鹽堿苜蓿的選育提供了一個新的理論支撐。

1 材料與方法

試驗于2019年5月—2020年9月在中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所農業農村部牧草種質資源與育種重點實驗室進行。

1.1 植物材料的培養

生態型R108蒺藜苜蓿種子保管于本實驗室。砂紙打磨種子表皮破除硬實，使用10%NaClO溶液清洗10 min，然后蒸餾水洗凈后放置于鋪好濾紙的培養皿中，于4℃春化2～3 d，后轉移至人工氣候培養箱中（光照16 h/黑暗8 h、溫度26℃/22℃、相對濕度60%）。待種子萌發長出兩片子葉后，將幼苗移至1/2 Hoagland營養液中培養，營養液購自西美杰生物公司，水培液每周更換一次。

生態型Col-0擬南芥種子用10%NaClO溶液清洗10 min，無菌水洗凈后種于1/2 MS（Phytotech，M 519）固體培養基上。4℃春化2～3 d后，移入人工氣候培養箱中（光照16 h/黑暗8 h，溫度22℃/20℃，相對濕度60%），待長出4片蓮座葉后，將其移入土（營養土∶蛭石＝1∶1）中生長。

1.2 lncRNA的鑒定

本實驗室前期工作中，曾對蒺藜苜蓿R108發芽期間鹽堿脅迫響應lncRNA進行高通量測序。本實驗的研究對象為測序得到的差異表達lncRNA（genbank accession：MW142219），序列初步分析結果表明其可能剪切形成一種miR167，初步命名為Mt-lncRNA 167。

1.3 Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c的克隆

提取1月齡蒺藜苜蓿葉片總RNA（植物總RNA提取試劑盒，上海普洛麥格生物科技公司），反轉錄為cDNA（Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser，Takara）。根據測序序列，使用NCBIprimer-blast（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi）設計PCR擴增引物Mt-lncRNA 167-F/R。使用Takara Ex Taq酶進行擴增，將擴增產物回收純化后（DNA純化回收試劑盒，TransGen Biotech）連接T載體（p EASY-T 5 Zero），轉入大腸桿菌Trans-T 1，挑取單克隆送至擎科生物公司進行測序。挑選比對正確菌株于40%甘油中低溫保存。

根據Ensembl plants中提供的pre-Mt-miR167c序列，分別在上游和下游保留100 bp保護序列設計引物Pre-Mt-miR167c-F/R。從1月齡蒺藜苜蓿基因組DNA中進行擴增，其余步驟與Mt-lncRNA 167克隆相同。

1.4 生物信息學分析

使用Coding Potential Calculator（CPC，http：//cpc.cbi.pku.edu.cn/）預測lncRNA的編碼蛋白潛力。ORF Finder在線工具預測lncRNA是否存在開放閱讀框（open reading frame，ORF）。此外，根據蛋白家族和結構域數據庫（Pfam和SMART）的同源性搜索，檢索是否存在與其他肽段匹配的功能結構域。通過ensembl plants網站blast確認lncRNA在染色體上的位置。從ensembl plants網站獲得Mt-miR167c的前體序列，利用RNAfolder（http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）在線工具對Mt-miR167c前體的二級結構進行預測。利用在線軟件psRNAtarget（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/home）預測Mt-miR167c的靶基因。在小RNA數據庫miRbase下載擬南芥、水稻、煙草（Nicotiana tabacum）、大豆等植物的miR167的成熟體序列，使用weblogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）分析蒺藜苜蓿miR167和數據庫中其他植物miR167s成熟序列的堿基保守性。通過MEGA 7.0軟件使用鄰接法構建不同miR167前體的系統進化樹，Bootstrap設置為1000次。利用DNAMAN（Version 9）進行多序列比對。利用Plantcare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/）分析Mt-lncRNA 167啟動子區域（5′上游2 kb）順式作用元件。

1.5 植物的非生物脅迫處理與表達分析

Mt-lncRNA 167、Mt-miR167c和靶基因MtARF6/8的組織特異性（根、莖、葉、花）表達分析所用材料來自2月齡蒺藜苜蓿。對于鹽（100 mmol·L—1NaCl）的處理，4周齡的水培蒺藜苜蓿分別在處理0、4、8、12、24、48及72 h后收集葉片。對于干旱（5%PEG 6000）和低溫（4℃）的處理，4周齡的水培蒺藜苜蓿分別在處理0、2、4、8、12、24 h后收集葉片。轉基因擬南芥的陽性鑒定材料來自移入土中后2周齡葉片。每組處理均測定Mt-lncRNA 167、MtmiR167c和靶基因MtARF6/8的表達量。利用熒光定量試劑盒（SYBR Premix ExTaq，Takara；miRcute Plus miRNA qPCR Kit，TIANGEN）在7300 RealTime PCR System上進行擴增，引物序列見表1。所有試驗均設置3個生物學重復，數據使用2—ΔΔCT（Livak）方法分析，利用t檢驗進行顯著性分析。

表1 本試驗所用到的引物序列Table 1 Primers used in the study

1.6 載體的構建與擬南芥遺傳轉化

測序比對正確的菌液擴大培養后提取質粒，使用無縫克隆的方法，設計連接目的基因與載體的接頭，通過無縫克隆試劑盒（p EASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit）連接至p CAMBIA 3301載體，轉化p CAMBIA 3301-Mt-lncRNA 167、p CAMBIA 3301-Mt-miR167c至大腸桿菌Trans-T 1中，挑取陽性單克隆送至擎科生物公司進行測序。轉化測序正確重組載體至農桿菌中（GV 3101，華越洋）。使用YEB液體培養基將農桿菌搖至OD600值為0.6～0.8，離心收集菌體，重懸浮于5%蔗糖溶液（含0.02%SilwetL-77，上海生工），之后采用花序侵染法轉化擬南芥。收獲T0代種子使用草銨膦（4 mg·L—1）篩選轉基因陽性植株。

1.7 轉基因擬南芥中Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c的鑒定和表達量分析

在含有草銨膦的培養基中篩選幼苗，提取DNA，以Mt-lncRNA 167-F和GUS為引物進行PCR陽性鑒定，分別獲得12株T0代Mt-lncRNA 167轉基因擬南芥、8株T0代Mt-miR167c轉基因擬南芥。以MtActinF和MtActinR為內參基因引物，鑒定不同轉基因株系中Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c的表達量。所有試驗均設置3個生物學重復，數據使用2—ΔΔCT（Livak）方法分析，利用t檢驗進行顯著性分析。

1.8 轉基因擬南芥花粉的收集與體外萌發

花粉的收集和體外萌發方法參照孫春麗等［36］的方法，擬南芥花粉進入成熟期時（大概在幼苗移栽20 d后），在上午10：00左右開始取花，此時花盛開并且具有最大散粉量。采摘50朵主莖上露白或剛剛盛開的花朵，置于1.5 mL離心管中，加入BK萌發液700μL，BK萌發液配方為5 mmol·L—1硼酸，8 mmol·L—1MgSO4·7H2O，1mmol·L—1KCl，5 mmol·L—1CaCl2，10 mmol·L—1肌醇，5 mmol·L—1MES。蔗糖濃度為20%，用KOH調p H值至7.0。在振蕩器上振蕩1 min，將上清液轉移至新離心管中，重復1次上述操作，將2次收集的上清液12000 r·min—1離心1 min沉淀花粉。

將上述收集好的花粉用BK萌發液懸浮，平鋪到含0.5%瓊脂糖的BK萌發培養基上，將培養皿封口以保持濕度，放置于23°C光照恒溫箱中培養，8 h后使用顯微鏡觀察花粉萌發情況。

1.9 轉基因擬南芥的下胚軸長度測量與耐鹽性鑒定

將擬南芥野生型（wild type，WT）與T2代超表達擬南芥種子消毒并清洗后（10%NaClO溶液消毒10 min，無菌水沖洗6～8遍），種植于1/2 MS固體培養基中，春化2 d后移入人工氣候培養箱，等待其生長7 d，用鑷子將其移出，拍照并用直尺測量下胚軸長度。

按 照 上 述 方 法 消毒并清 洗 擬 南 芥 種 子，將其分 別 種 植 于0 mmol·L—1NaCl、125 mmol·L—1NaCl、0 mmol·L—1Mannitol、100 mmol·L—1Mannitol的1/2 MS固體培養基中（每皿種植50粒，3組重復），春化2 d后，移入人工氣候培養箱中每日統計發芽率。

1.10 數據處理

采用Excel 2016統計分析實驗數據，結果以平均值±標準誤表示。用IBM SPSS Statistics 26、Excel 2010、MEGA 6.0等軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 Mt-lncRNA 167、Mt-miR167c的鑒定與生物信息學分析

Mt-lncRNA 167為長度1444 bp的RNA長鏈。使用Coding Potential Calculator（CPC，http：//cpc.cbi.pku.edu.cn/）預測lncRNA的編碼潛力以及采用ORF Finder在線工具預測lncRNA是否存在ORF，發現MtlncRNA 167編碼能力為負值，不存在長度大于30的ORF，故Mt-lncRNA 167符合lncRNA的基本特征。通過ensembl plants網站blast確認該lncRNA在染色體上的位置，發現Mt-lncRNA 167位于4號染色體25786943—2578838位置，且與一個已注釋的miR167在位置上重合（圖1A），分析Mt-lncRNA 167可能是該miR167的前體，作為miR167的前體發揮作用。從ensembl plants網站獲得Mt-miR167c的前體序列，利用RNAfolder對MtmiR167c前體的二級結構進行預測（圖1B），最小折疊自由能（minimum free energy，MEF）為—37.5 kcal·mol—1，能形成穩定的莖環結構，與蒺藜苜蓿中本來存在的Mt-miR167a、Mt-miR167b結構相似，故按照順序將其命名為Mt-miR167c。預測其成熟體位于莖環結構5′端，序列為：5′-UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUU-3′。利用DNAMAN（Version 9）將Mt-miR167c與蒺藜苜蓿中miR167a/b成熟體序列和擬南芥中miR167a/b/c/d進行比對，發現他們的序列相似度為93.96%。且在蒺藜苜蓿中，三者只在最后一位有所差異（圖1C）。

圖1 Mt-lncRNA167與Mt-miR167c的鑒定Fig.1 Identification of Mt-lncRNA167 and Mt-miR167c

在小RNA數據庫中下載擬南芥、水稻、煙草、大豆等植物的共73個miR167的前體序列及成熟體序列，使用weblogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）分析蒺藜苜蓿miR167和數據庫中其他植物miR167成熟序列的堿基保守性，結果表明miR167家族在不同物種中具有很高的保守性，在3、15位上的堿基保守性最高（圖2）。且蒺藜苜蓿miR167c序列與其他miR167家族大部分序列保持一致，說明miR167家族在進化上保守。

圖2 miR167成熟體序列堿基保守性分析Fig.2 Analysis of base conservatism of miR167 mature sequence

選取主要模式植物及主要經濟作物包括擬南芥、煙草、大豆、蒺藜苜蓿、花生（Arachis hypogaea）、番茄、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、小米（Setaria italica）、陸地棉（Gossypium hirsutum）、水稻、百脈根、玉米（Zea mays）、高粱、小麥（Triticum aestivum）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）15個物種中共17個miR167前體構建系統發育樹（圖3）。由于miR167家族在不同物種中極其保守，故發育樹并未表現出明顯的進化規律。同屬茄科的番茄和馬鈴薯聚為一支，豆科植物蒺藜苜蓿miR167a和b分別與陸地棉和煙草具有更近的親緣關系。而Mt-miR167c與同屬豆科的花生親緣關系最近。進化樹將17個miR167分為兩個亞類，第一亞類大部分是來自豆科、茄科的雙子葉植物，第二亞類大部分是來自禾本科的單子葉植物。但這并不絕對，比如第一亞類中存在一個小米的miR167，第二亞類中包含來自豆科的大豆和百脈根的miR167。

圖3 pre-miR167s的親緣關系樹Fig.3 Phylogenetic tr ee of pre-miR167s

用在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Plantcare/html/）對轉錄起始位置上游長度為2 kb啟動子區域序列進行分析。發現在Mt-lncRNA 167啟動子區域中，存在著響應干旱、水楊酸、低溫和光的順式作用元件，說明Mt-lncRNA 167可能在植物非生物脅迫抵抗中起到作用（表2）。利用在線軟件psRNAtarget預測Mt-miR167c的靶基因，結果表明，蒺藜苜蓿中miR167c預測靶基因包括生長素響應因子、E3泛素蛋白連接酶編碼基因和RNA聚合酶Ⅱ轉錄中介蛋白編碼基因等。由于ARF6/8評分最高，且在其他物種中有所研究，故將MtARF6/8列為本研究對象［13］（表3）。

表2 Mt-lnc RNA167的啟動子順式作用元件分析Table 2 Cis-acting element analysis of pr omoter of Mt-lnc RNA167

表3 psRNAtarget預測Mt-miR167c的靶基因Table 3 Prediction of the target gene of Mt-miR167c by psRNAtarget

2.2 Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c的表達模式分析

Mt-lncRNA 167在蒺藜苜蓿的根、莖、葉、花中均有表達，在莖中的表達量最低，在葉中的表達量最高，是莖的17倍，根和花中的表達量相似，分別是莖中的7.3和7.6倍（圖4）。Mt-miR167c表達模式與Mt-lncRNA 167相似，在葉中表達量最高，是根的48.3倍，其次在花中表達量較高，為根的10.6倍。靶基因MtARF6和MtARF 8與之相反，在葉片中表達量低，在花中表達量最高，分別為根的33.6和22.3倍。

圖4 Mt-lncRNA167、Mt-miR167c、MtARF6/8在不同組織中的表達Fig.4 The relative expression of Mt-lncRNA167，Mt-miR167c，MtARF6/8 in different tissues of M.truncatula

針對Mt-lncRNA 167啟動子序列中存在的各種順式作用元件的功能，研究了Mt-lncRNA 167以及MtmiR167c在鹽、低溫、干旱等脅迫條件下的表達情況。結果顯示Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c在不同的非生物脅迫處理下均有響應，但各不相同（圖5～7）。

在100 mmol·L—1NaCl處理下，Mt-lncRNA 167的表達量在處理之初（4 h）顯著升高，約為對照的2.7倍。之后表達量略有下降，但一直高于對照（1.1～1.7倍）。表明Mt-lncRNA 167的表達量只受到鹽脅迫的短暫誘導，并不能長期響應。與之相應的，Mt-miR167c的表達量也隨著處理時間的累計呈上升趨勢，并且在所有時間點顯著高于對照，在8 h處理后達到最高值（為對照的2.7倍）。Mt-miR167c靶基因MtARF 6和MtARF8的表現與其相反，在處理之初MtARF6和MtARF8均受到顯著抑制，二者表達量均在處理12 h時達到最低值（均約為對照的0.4倍）。但相比于MtARF6，鹽處理對MtARF8的抑制效果更持久。直到處理72 h，MtARF8的表達量依然為對照的0.4倍，但MtARF6的表達量在24 h后開始上升并超過對照。總體來看，在鹽處理的情況下，Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c的表達量上升，而MtARF6/8的表達量呈下降趨勢（圖5）。

圖5 Mt-lncRNA167、Mt-miR167c、MtARF6/8在鹽脅迫（100 mmol·L-1 NaCl）處理下的表達Fig.5 The r elative expr ession of Mt-lncRNA167，Mt-miR167c，MtARF6/8 under NaCl（100 mmol·L-1）tr eatment

在4℃的低溫處理下，Mt-lncRNA 167表達量在所有時間點均顯著下降。Mt-miR167c的表達趨勢與其相同，在所有處理時間點均顯著下降，在24 h達到最低值（為對照的0.4倍）。MtARF6和MtARF8表達量也呈現顯著下降趨勢，特別是MtARF6，在所有時間點均顯著降低。MtARF8表達量在低溫處理8 h時達到最低（為對照的0.4倍）。故在低溫處理下，Mt-lncRNA 167與Mt-miR167c表達趨勢相同，均為顯著下降。靶基因MtARF6和MtARF8也呈現顯著下降趨勢（圖6）。

圖6 Mt-lncRNA167、Mt-miR167c、MtARF6/8在低溫脅迫（4℃）處理下的表達Fig.6 The r elative expr ession of Mt-lncRNA167，Mt-miR167c，MtARF6/8 under cold str ess（4℃）tr eatment

在5%PEG 6000的干旱處理下，Mt-lncRNA 167表達水平存在波動，總體保持上升的趨勢，在處理8 h時表達水平最高，達到對照組的1.9倍。Mt-miR167c表達水平也在處理下上升，但升高幅度較小，在處理2 h時達到峰值（為對照的1.3倍）。MtARF 6和MtARF 8表達水平均先下降再升高，二者均在處理2 h時達到最低（分別為對照的0.1和0.5倍）。故在干旱情況下，Mt-lncRNA 167與Mt-miR167c表達趨勢相同，與MtARF6/8表達趨勢相反（圖7）。

圖7 Mt-lncRNA167、Mt-miR167c、MtARF6/8在干旱脅迫（5%PEG 6000）處理下的表達Fig.7 The relative expression of Mt-lncRNA167，Mt-miR167c，MtARF6/8 under drought（5%PEG 6000）treatment

故lncRNA 167-miR167c-ARF 6/8三者都可以響應不同的非生物脅迫。在3種非生物脅迫下，Mt-lncRNA 167與Mt-miR167c的表達趨勢均呈正相關，符合二者互作關系的預測，即Mt-lncRNA 167作為Mt-miR167c的前體。在鹽脅迫和干旱脅迫下，Mt-miR167c的表達量與MtARF6/8的表達量趨勢相反，符合二者為Mt-miR167c靶基因的預測，即Mt-miR167c會在MtARF 6/8轉錄后發生作用，在特定位點切割mRNA，抑制其表達水平。但在低溫脅迫下，MtARF6/8與Mt-miR167c表達水平正相關。

2.3 超表達Mt-lncRNA 167、Mt-miR167c轉基因擬南芥的分析

為驗證Mt-lncRNA 167、Mt-miR167c的功能以及二者之間的關系，分別構建35S∶∶Mt-lncRNA 167-GUS和35S∶∶Mt-miR167c-GUS載體，采用花序侵染法轉化擬南芥（Col-0）。使用4 mg·L—1草銨膦篩選T0代種子。共篩選出11個Mt-lncRNA 167轉基因株系（OE1～11）和8個Mt-miR167c轉基因株系（OE1～8）。對轉基因植物（T2）的Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c轉錄水平驗證表明，與野生型（WT）相比，轉基因擬南芥中Mt-lncRNA 167與Mt-miR167c均異位表達，且不同株系中表現差異大（圖8A，B）。如Mt-lncRNA 167超表達植株表達量最高的OE9為最低的OE11的49.9倍，Mt-miR167c超表達植株表達量最高的OE3為最低的OE1的23.5倍。

圖8 超表達擬南芥中Mt-lncRNA167、Mt-miR167c的表達量分析Fig.8 Analysis of the relative expression level of Mt-lncRNA167 and Mt-miR167c in the overexpressed Arabidopsis

此外，本研究分別在超表達Mt-lncRNA 167和超表達Mt-miR167c擬南芥中選取3個株系進行靶基因ARF6/8表達量的檢驗（圖8C，D）。結果可以看出在超表達Mt-lncRNA 167的8、9、10號株系中，Mt-miR167c的表達量也有所上升，如在株系8中，Mt-miR167c的表達量上升至對照的6.5倍。相應地，Mt-miR167c的靶基因ARF6/8在超表達擬南芥植株中表達量降低，但ARF 6的降低幅度大于ARF 8，如在株系9中，ARF6的表達量降低至對照的0.2倍，而ARF 8僅降低至對照的0.5倍。在超表達Mt-miR167c的株系3、5、6中，ARF6和ARF8表達量也呈降低趨勢。相同的是，ARF6的降低幅度依然大于ARF8。如在株系3中，ARF6表達水平低于對照的0.1倍，而ARF8僅降低至對照的0.3倍。同時，本研究發現超表達Mt-lncRNA 167對ARF6/8的抑制效果弱于直接超表達Mt-miR167c。

超表達Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c植株均表現出生育缺陷的表型，在轉基因擬南芥中，果莢和花絲顯著縮短，花藥不能正常釋放花粉，花粉粒萌發率低。WT花瓣正常開放，而超表達Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c擬南芥花瓣閉合（圖9A，C～E）。WT角果延長且飽滿，而超表達Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c擬南芥角果很短，不向外延長（圖9B）。使用顯微鏡觀察可知，超表達Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c擬南芥與WT具有相同結構和數量的花器。但剝開花瓣與萼片可觀察到，與WT相比，超表達Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c株系的雄蕊花絲過短，導致花藥無法接觸柱頭完成正常授粉（圖9F～H）。這種特殊的結構特征可能是超表達Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c株系表現出生育缺陷的原因。

圖9 Mt-lncRNA167、Mt-miR167c超表達擬南芥的花結構Fig.9 The flower str ucture of over expr essed Mt-lnc RNA167 and Mt-miR167c Arabidopsis

另外，超表達Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c植株的下胚軸顯著長于WT（圖10）。超表達Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c植株下胚軸均顯著延長，但超表達Mt-miR167c植株子葉明顯偏小、展開程度低，超表達MtlncRNA 167植株的子葉卻與WT相似。且超表達Mt-miR167c植株下胚軸也顯著長于超表達Mt-lncRNA 167的植株。

圖10 WT和超表達擬南芥的幼苗和下胚軸長度Fig.10 Seeding and hypocotyl length of WT and overexpressed Arabidopsis

通過花粉離體培養試驗測定植株花粉活力，結果顯示，同一大小視野中Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c超表達植株花粉數量明顯較少，說明花藥不正常釋放花粉（圖11）。以花粉管伸出長度大于花粉直徑為準，隨機選取5個視野，統計花粉萌發百分比，WT在萌發培養基中8 h后萌發率可達50%，超表達植株花粉活力顯著弱于WT。

圖11 擬南芥花粉的體外萌發Fig.11 In vitro germination of Arabidopsis pollen

為驗證Mt-lncRNA 167與Mt-miR167c對擬南芥非生物脅迫抗性的影響，分別在鹽脅迫（125 mmol·L—1NaCl）和干旱脅迫（100 mmol·L—1Mannitol）下，對野生型和T2代超表達擬南芥進行每日發芽率測定。在對照條件下，超表達Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c的擬南芥和WT最終發芽率基本一致，均能達到100%的發芽率。在鹽脅迫（125 mmol·L—1NaCl）處理下，WT和超表達植株均受到了一定程度的抑制，發芽時間晚于對照。Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c超表達植株的最終發芽率顯著大于WT，且在發芽過程中，發芽率也高于WT（圖12A，B）。在干旱脅迫下，植株發芽時間沒有推后，且最終發芽率在不同株系中沒有明顯差異（圖12C，D）。但干旱脅迫對WT的抑制程度明顯大于超表達植株，發芽第2天，超表達MtlncRNA 167和Mt-miR167c擬南芥發芽率可分別達到35.3%和41.3%，WT的發芽率僅為16.0%（圖12D）。故在鹽脅迫和干旱脅迫中，WT均比超表達植株受到更嚴重的抑制，說明超表達MtlncRNA 167與Mt-miR167c增強了擬南芥對鹽和干旱脅迫的抗性。

圖12 不同濃度鹽脅迫和干旱脅迫下轉基因擬南芥的發芽率Fig.12 Ger mination rate of over expressed Arabidopsis under differ ent salinity and dr ought stress

3 討論

近年來，高通量測序等新興技術的出現，極大地提高了對lncRNA的功能意義和作用機制的認識。lncRNA被普遍定義為長度超過200 nt的非編碼RNA，其作用機制和生物學功能復雜多樣，可與DNA、RNA、蛋白質分子等相互作用，在染色質、轉錄和轉錄后水平起著重要的調節作用。目前有關lncRNA與miRNA關聯的研究，主要集中在兩個方面。一方面是lncRNA可以作為eTM發揮作用，即lncRNA通過結合miRNA最終裂解，導致miRNA表達水平下降無法發揮作用，最終使得miRNA的靶基因無法受到抑制。隨著生物信息學和測序技術的發展，這種關系在植物中被廣泛報道，但真正得到證實的卻有限。INDUCED BYPHOSPHATE STARVATION 1（IPS1）是植物中第一個發現的eTM，IPS1可以結合miR399，抑制miR399的活性，增加靶基因PHO2的表達，維持植物在磷酸鹽饑餓條件下的正常生長［37］。另一方面，是lncRNA作為產生miRNA或siRNA（small interfering RNA）的前體而產生作用。根據lncRNA的定義來說，miRNA和siRNA的前體由于不編碼蛋白質，也屬于lncRNA的一種。在植物中，這種作用模式研究較少，且只有關于產生siRNA的研究。比如在桑樹（Morus alba）中，Mulnc1被muli-mir3954裂解，產生si16157可以靶向并沉默桑樹中CML 27的表達，該基因在介導植物抗逆性方面發揮著重要作用［38］。關于lncRNA作為miRNA前體的研究，只在動物中有報道過，比如lncRNAmiR100 mg產生miR-100和miR-125b可介導西妥昔單抗耐藥性［39］，lncRNAH 19的第一外顯子區可編碼產生miR-675-5p/3p［40］。故本研究將目光聚焦于能編碼miRNA、作為miRNA前體發揮作用的lncRNA，初步揭示其互作關系和功能。

在本實驗室的前期工作中，對蒺藜苜蓿R108發芽72 h的材料進行了lncRNA深度測序，得到了大量響應鹽脅迫的lncRNA。早在2015年，Wang等［32］通過高通量測序鑒定了蒺藜苜蓿中參與滲透脅迫和鹽脅迫的lncRNA，但其研究材料為受到滲透脅迫和鹽脅迫的葉片和根組織。本實驗室的轉錄組測序來源于萌發幼苗組織，故測得大量與之不同的lncRNA樣本。其中，Mt-lncRNA 167因與miR167家族成員存在特殊的位置關系而引起注意，初步分析Mt-lncRNA 167作為此miR167的宿主前體發揮作用，可以促進該miR167的表達。

通過兩種不同的在線工具分析了Mt-lncRNA 167的編碼潛能，均證明Mt-lncRNA 167是一個不能編碼肽段的RNA片段，故證實了其為lncRNA。miRNA的前體常形成莖環狀的二級結構，成熟的miRNA序列會位于莖環結構的莖部區域［41］。為證實新miR167確實屬于蒺藜苜蓿miR167家族，預測了該miR167前體的二級結構，發現其與Mt-miR167a/b同樣形成莖環，且成熟體位于5′端莖部。該miR167成熟體序列與Mt-miR167a、Mt-miR167b僅在最后一位有差距。植物miR167是一個保守性很高的家族，新miR167成熟體與大部分植物體內miR167成熟體序列一致，故該miR167確為Mt-miR167家族成員，命名為Mt-miR167c。至此，本研究分別在蒺藜苜蓿中鑒定了一個全新的lncRNA和屬于miR167家族的一個新成員Mt-miR167c。

根據Mt-lncRNA 167啟動子區域的預測，對Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c以及靶基因ARF6/8進行不同逆境處理下的表達模式分析。總體來看，在鹽處理下，Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c的表達量上升，且ARF6/8的表達量呈下降趨勢。在低溫處理下，Mt-lncRNA 167表達量與Mt-miR167c表達趨勢相同，均為顯著下降，但靶基因ARF6和ARF8也呈現顯著下降趨勢。在干旱情況下，Mt-lncRNA 167與Mt-miR167c表達趨勢相同，表達量顯著升高，而ARF6/8表達呈先下降再升高趨勢。可以看出，在3種脅迫處理中，Mt-lncRNA 167與Mt-miR167c表達量均表現出了相同的變化趨勢，這與之前的研究結果相符，即作為miRNA前體的lncRNA應與miRNA表達模式相同［39—40］。在鹽脅迫與干旱脅迫中，miR167c與靶基因ARF6/8表達水平是相反的，由于miRNA的作用原理為切割或翻譯抑制靶基因的表達水平［42］，再結合其他植物中關于miR167靶基因的報道，可以初步判定MtARF6/8為miR167的靶基因。但二者負相關的表達趨勢也并不存在于脅迫條件，比如在蒺藜苜蓿受到低溫脅迫時，miR167與ARF6/8就同時下降。分析其原因，由于ARF與其他的轉錄因子不同，其在植物體內既可以作為激活因子也可以作為抑制因子。ARF作為激活因子會結合生長素應答基因啟動子中的TGTCTC生長素應答元件（auxin response elements，AuxRE），介導以生長素為中心的轉錄調控［43］。ARF作為抑制因子可以通過與激活劑ARFs異二聚或競爭DNA結合位點來抑制其轉錄活性［44］。基于ARF轉錄因子家族的復雜性，且由于miRNA作用于靶基因的調控方式為轉錄后調控，在生物體中還存在著大量的轉錄前調控因子，故即便miRNA表達量下降，并未對靶基因mRNA長鏈進行切割，但由于低溫條件下其他調控因子的存在，ARF6/8基因依然受到了抑制。本研究認為ARF6/8在低溫脅迫下不僅受到miRNA的轉錄后調控，也可能存在一些啟動子區域的轉錄前調控，故二者關系不符合嚴格的負相關。

將Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c均在擬南芥中超表達，得到了與超表達At-miR167相同的表型［21］，即角果不延長，花絲異常短，花藥不能正常釋放花粉，花粉粒不萌發。通過體式顯微鏡的觀察可知，轉基因植株的花器官數量雖與WT相同，花絲長度卻明顯短于WT，這導致花藥并不能接觸柱頭完成授粉。且花粉體外萌發試驗證明，Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c超表達植株花粉數量和花粉活力都明顯低于野生型。這表明Mt-miR167c與其家族的其他成員一樣，在植物生長繁殖中發揮重要調控作用。由于該lncRNA是一個鹽脅迫的差異表達lncRNA，將超表達植株和WT進行非生物脅迫抗性的分析，發現在鹽脅迫和干旱脅迫中，WT均比超表達植株受到更嚴重的抑制，說明超表達Mt-lncRNA 167與Mt-miR167c增強了擬南芥對鹽和干旱脅迫的抗性。miR167家族早先被報道過在檉柳（Tamarix chinensis）、鹽穗木（Halostachyscaspica）等植物中表達模式響應鹽脅迫［45—46］，且在本研究中，miR167c在蒺藜苜蓿中也響應鹽、干旱和低溫脅迫。故作為miR167前體的Mt-lncRNA 167和MtmiR167c一樣，在植物抵抗非生物脅迫過程中發揮作用。在早先的報道中，ARF8通過調節植物光照條件下生長素穩態影響擬南芥下胚軸伸長［47］，在后續研究At-miR167功能時，也發現了下胚軸伸長的現象［21］，再次證明miR167對ARF8的靶向作用。故在本實驗中，也對擬南芥下胚軸長度給予關注，發現超表達Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c植株下胚軸均顯著延長，且超表達Mt-miR167c植株下胚軸也顯著長于超表達Mt-lncRNA 167的植株。但超表達Mt-miR167c植株子葉明顯偏小、展開程度低，超表達Mt-lncRNA 167植株子葉形態卻與WT相同。分析其原因，由于Mt-lncRNA 167為Mt-miR167c的前體，即超表達Mt-lncRNA 167間接地超表達Mt-miR167c，植株中miR167c的表達水平低于直接超表達Mt-miR167c的植株，故表型不如超表達Mt-miR167c植株明顯。

在本實驗中，Mt-lncRNA 167超表達植株與Mt-miR167c超表達植株表型相同，分析二者具有相同的功能。關于二者具有相同功能的原因，本研究更傾向于Mt-lncRNA 167作為Mt-miR167c的前體，促進Mt-miR167c的表達，原因在于本研究選取的3株具有表達梯度的Mt-lncRNA 167超表達植株中，miR167c表達量均有上升。綜合以上，本研究認為Mt-lncRNA 167的確具有產生Mt-miR167c的功能，Mt-lncRNA 167是作為Mt-miR167c的前體而發揮功能的。另外，研究發現在Mt-lncRNA 167和Mt-miR167c的超表達植株中，ARF6和ARF8的表達量均有明顯下降，這與之前的研究相符，即miR167超表達植株與ARF6/8雙突變體擁有相同的表型［19］。且在全部材料中ARF 6的表達量均低于ARF 8，表明miR167c對ARF6的抑制效果高于ARF8，故對于擬南芥生育缺陷的表型，ARF6可能起到主要作用。結合蒺藜苜蓿中三者的表達模式，綜合超表達植株的表型關系，分析得到MtlncRNA 167與Mt-miR167c以及靶基因ARF6/8存在互作網絡關系。

4 結論

本研究對蒺藜苜蓿鹽脅迫響應的一個新預測lncRNA及其剪切產物miRNA進行了研究。通過生物信息學和轉錄水平表達分析確定該lncRNA為一個真實的lncRNA。在此lncRNA的相同基因座上發現一個新miRNA，通過生物信息學分析確定具有miRNA的基本特性和miR167家族的特征，將其命名為Mt-miR167c，將lncRNA命名為Mt-lncRNA 167。對Mt-lncRNA 167、Mt-miR167c、靶基因ARF6/8在3種非生物脅迫下的表達模式進行分析，發現在大部分情況下，Mt-lncRNA 167與Mt-miR167c表達模式相同，與靶基因ARF6/8表達模式相反。將Mt-lncRNA 167與Mt-miR167c在擬南芥中過表達，超表達植株表現出生育缺陷、抵抗非生物脅迫和延長下胚軸的表型。且在超表達材料中，Mt-lncRNA 167、Mt-miR167c和ARF6/8的表達模式與上述相同。綜合以上，本研究認為Mt-lncRNA 167作為Mt-miR167c的前體發揮作用，而Mt-miR167c通過抑制ARF6/8的表達影響擬南芥的育性和非生物脅迫抗性。本研究鑒定了蒺藜苜蓿中一個新的lncRNA，和miR167家族的一個新成員MtmiR167c。在蒺藜苜蓿中構建了Mt-lncRNA 167-Mt-miR167c-MtARF6/8的作用網絡，該網絡可能在調控植物育性的過程中發揮關鍵作用。