全基因組水平蒺藜苜蓿反轉錄轉座子IRAP分子標記開發及應用

尹曉凡，魏娜，鄭淑文，劉文獻

（蘭州大學草地農業生態系統國家重點實驗室，蘭州大學農業農村部草牧業創新重點實驗室，蘭州大學草地農業教育部工程研究中心，蘭州大學草地農業科技學院，甘肅 蘭州 730020）

遺傳多樣性是育種計劃的基礎，全面了解植物物種的種群結構和遺傳多樣性譜系是其保護、管理和利用植物遺傳資源的前提，而深入了解優良育種材料的種質多樣性和相互關系是選擇優良親本組合和增加作物育種雜種優勢的先決條件［1］。在傳統育種中，形態學和表型標記已廣泛用于遺傳變異的分析，但這些方法僅限于改變表型和高度遺傳性狀方面，且存在較多的局限性和不穩定性（例如受限于土地面積和育種時間，以及不穩定的環境條件等）［2］。隨著分子生物學技術的發展，各種DNA分子標記技術已被廣泛使用。19世紀70年代，第一個基于DNA的分子標記技術——限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）被開發。隨后，科學家相繼開發了各種分子標記方法，例如隨機擴增多態性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、簡 單 序 列 重 復（simple sequence repeat，SSR）、擴 增 片 段 長 度 多 態 性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、表達序列標簽（expressed sequence tag，EST）和單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）。分子標記主要是基于DNA序列的變異性或多態性，在基礎和應用遺傳研究（例如遺傳圖的構建以及基因或定量性狀基因座的繪制）和育種（例如標記輔助選擇和基因組選擇）中發揮著重要作用［3］。近年來基于DNA的分子標記能夠克服眾多與表型有關的局限性，并能夠在單位成本和時間效益內表現出較高的效率和優勢，已成為構建種群、種質及物種之間DNA指紋圖譜和遺傳分析的橋梁［4］。

反轉錄轉座子是一類在植物基因組中廣泛存在的DNA序列，是植物基因組中最豐富的移動元素，幾乎存在于所有高等植物中。其中，長末端重復序列（long terminal repeated sequence，LTR）反轉錄轉座子是幾乎所有真核基因組的主要組成部分，可占整個基因組的40%～90%［5］。反轉錄轉座子包括長末端重復轉座子（LTR—RT）和非長末端重復轉座子（non-LTR）。LTR—RT根據蛋白質結構域分為Gypsy和Copia家族［6］。基于已開發的幾種反轉錄轉座子的分子標記技術，包括序列特異性擴增多態性（sequence-specific amplified polymorphism，SSAP）、反轉錄轉座子擴增多態性（inter-retrotransposon amplified polymorphism，IRAP）和反轉座子微衛星擴增（retrotransposon-microsatellite amplified polymorphism，REMAP），基于反轉錄轉座子的插入多態性（retrotransposonbased insertion polymorphism，RBIP）和引物間結合位點多態性（inter-primer binding site polymorphism，iPBS）。IRAP標記最初由Kalendar等［7］開發，旨在識別不同的大麥（Hordeum vulgare）品種，IRAP標記使用從反轉錄轉座子LTR序列設計的引物，對兩個附近的反轉錄轉座子之間的DNA序列進行PCR擴增，近幾年該類型引物已廣泛用于研究遺傳多樣性，遺傳關系和評價種質資源。與其他標記相比，由于其較長的末端重復序列，在真核生物的基因組各個染色體中廣泛分布，具有拷貝數多、特異性高、通用性強、信息豐富、可轉移性等特征，可用于開發和應用各種分子標記［8］。由于這些特征，反轉錄轉座子已成為近些年來研究植物遺傳多樣性的首選標記，并已被廣泛用于各種植物遺傳多樣性和多態性分析，例如，利用IRAP分子標記技術分析了59份煙草（Nicotiana tabacum）品種間遺傳差異，根據煙草反轉錄轉座子Tnt1、Tto1、Tnd21序列設計的5個引物擴增出151個條帶，其中多態性帶145條，多態性比率高達96.03%［9］；PDR1是豌豆（Pisum sativum）Ty1-copia家族反轉錄轉座子，SSAP引物基于PDR1的多嘌呤域設計而成，用于區分豌豆15個品種和56份品系并構建遺傳圖譜［10］；Holasou等［11］利用IRAP和REMAP標記技術評估伊朗49個小麥（Triticum aestivum）品種，通過9個IRAP引物和20個REMAP引物分別擴增出90和126個基因座，多態性比率分別為81.78%和86.40%。大量研究表明，同源性LTR—RTN植物科屬之間的反轉錄轉座子序列可用于整個物種［12］。

蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）作為豆科模式植物是繼擬南芥（Arabidopsisthaliana）、水稻（Oryza sativa）之后第3個完成全基因組測序的植物。蒺藜苜蓿與大多數豆科植物［紫花苜蓿（Medicago sativa）、大豆（Glycine max）、豌豆、三葉草（Trifolium hybridum）等］的遺傳關系較近，并具有良好的共線性，尤其與紫花苜蓿具有很高的同源性。因而從蒺藜苜蓿獲得的信息可以用于其他豆科植物，這對于挖掘豆科植物遺傳資源，促進豆科作物和苜蓿等牧草的育種具有重要意義［13］。紫花苜蓿是最重要和廣泛種植的豆類飼料作物，具有較高的營養質量和經濟價值，其優異的營養價值使其非常適合奶牛和牲畜生產［14—15］。苜蓿不僅具有作為牲畜飼料的價值，而且在減少侵蝕和養分流失，增強土壤固碳和增加氮肥方面起著重要作用［16］。苜蓿雜種優勢已被證明是提高牧草產量和其他重要性狀的一種方法［17］。由于最早發展起來的形態學標記數量有限，表型選擇費時費力，且易受外界環境及植物生長發育階段等因素的影響，不利于在遺傳、育種等研究過程中應用。然而分子標記的開發和運用，其擁有龐大的標記數量，且不受發育階段及外界環境的干擾，因而在遺傳學研究領域具有很高的利用價值。在模型物種（蒺藜苜蓿）中發現基因和確定基因功能相對容易，通過比較基因組學將遺傳信息從蒺藜苜蓿擴展應用到其近緣物種已成為一種重要策略［18］。因此，本研究首次在蒺藜苜蓿的全基因組水平上基于LTR信息設計IRAP標記引物用于40份紫花苜蓿種質，評估鑒定不同紫花苜蓿品種的遺傳差異性，對候選IRAP標記進行了大規模搜索和開發，以評估其潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年4—9月進行。本研究共涉及40份紫花苜蓿種質資源用于苜蓿遺傳多樣性分析（表1）。其中20份國外品種由美國農業部國家植物種質系統提供，20份國內品種由農業農村部國家畜牧總站和國家種質資源庫提供。上述測試材料于2018年4月種植在蘭州大學臨澤實驗站。

表1 40份紫花苜蓿種質類型及來源Table 1 40 alfalfa germplasm types and sources

1.2 DNA提取和檢測

每份苜蓿品種采用30個單株的新鮮葉片混合取樣［19］，使用CTAB法提取苜蓿基因組總DNA（gDNA）［20］，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。用Nanodrop分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳（OD260/OD280≈1.8）測量DNA濃度和質量。將DNA樣品稀釋至25 ng·μL—1的工作溶液，并在4℃下保存直至使用。

1.3 引物設計與PCR擴增

運用LTR—FINDER［21］在全基因組水平分析鑒定蒺藜苜蓿LTR反轉錄轉座子，利用Array Designer 4軟件［22］設計開發IRAP引物標記。共設計出431個IRAP引物，進而根據染色體位置信息和IRAP上下游引物標記方法選擇設計了69對引物組合，用于下一步實驗（表2），并進行3次重復試驗。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表2 引物信息及序列Table 2 Primer and sequences information applied in this study

PCR擴增在PTC-200熱循環儀上進行：總體積為10μL，包含2×Taq PCR MasterMix 5μL，模板DNA 1μL，ddH2O 2μL，正向和反向引物1μL。PCR擴增程序如下：在94℃變性3 min；在94～51℃下退火30 s，在72℃下延伸30 s，9個循環；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃延伸7 min；儲存于4℃冰箱。使用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacryamide gel electrophoresis，PAGE）檢測PCR擴增產物，將樣品點樣至2μL，并在210 V電泳110 min，并通過AgNO3溶液銀染視化，并拍照保存電泳圖譜。

續表Continued Table

1.4 數據處理與分析

通過手動比較和軟件校準對IRAP分子標記的擴增產物圖譜進行統計分析。每個樣品中所有可檢測的擴增條帶按照分子量編號讀取，在相同的遷移位置有帶（1）或缺失（0）進行評分，以建立“0，1”矩陣來確定遺傳關系。使用軟件NTSYSpc 2.1的Dice系數計算IRAP數據的基因型［23］。統計并計算總條帶數（total bands，TB）、多態性條帶（polymorphic bands，PB）、多態性條帶比率（percentage of polymorphic bands，PPB）、預期雜合度（expected heterozygosity，He）和多態性信息含量（polymorphic information content，PIC）［24］。PIC通過PIC＝1—∑(Pij)2的公式進行計算（Pij表示第i個等位基因和第j個等位基因的基因頻率）［25］。使用算術平均值非加權組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）產生相似系數矩陣，以此估計基因型之間的遺傳相關性并生成樹狀圖。使用Structure 2.3.1軟件分析群體遺傳結構［26］。估計最佳群體組群數（K），亞群的數量為1～11，最可能的K值由數據lnP（D）的對數似然性和STRUCTURE HARVESTER中的ΔK確定［27］。

2 結果與分析

2.1 IRAP標記的開發及分析

為了評估紫花苜蓿基因組中LTR多態性，將基于蒺藜苜蓿LTR反轉錄轉座子設計的69對引物進行IRAP分子標記試驗（表2）。根據多蛋白（polyprotein，POL）開放閱讀框架和內部酶基因中所編碼的蛋白質順序，LTR反轉錄轉座子又分為Ty1-copia和Ty3-gypsy兩個超家族，即Copia和Gypsy家族。通過蒺藜苜蓿全基因組信息數據，對設計的431個IRAP標記引物按照LTR進行分類（表3）［28］，分析已識別的LTR總數，檢索序列的總長度（bp）及平均總長度（bp），平均配對分數以及用于分類和識別的LTR總數的百分比。其中，Gypsy家族占已鑒定LTR總數的24.40%（105），Copia家族占22.30%（96），未知的占53.40%（230）。Gypsy家族在LTR中的比例略大于Copia家族；總長度和平均長度也略大于Copia家族。

表3 基于蒺藜苜蓿全基因組序列設計引物分類信息Table 3 Information of designing primers based on the M.truncatula sequence

根據染色體位置信息對鑒定出的LTR進行染色體分布統計分析（圖1），結果顯示，其中未知（Unknown）主要分布在染色體1、2、3上；Gypsy家族主要分布在染色體1、2、3、4、6上，分別有11、15、22、14、16個，染色體5上分布最少，僅有2個；Copia家族主要分布在染色體1、3、5、8上，分別有17、18、11、14個，染色體2上分布最少，僅有6個。

圖1 IRAP引物染色體分布信息Fig.1 Chromosome distribution information of IRAP primers

2.2 IRAP標記的多態性分析

本研究開發設計出431個引物，并通過IRAP分子標記方法組合形成69對IRAP引物組合。PCR擴增篩選出37對具有高多態性和優良穩定性的引物組合，并對40份紫花苜蓿品種進行遺傳多樣性分析（表4）。

這些多態性引物組合可擴增出多態性高、清晰、重復性好的差異帶型（圖2）。由表4可知，37對多態性IRAP引物組合產生325條總條帶和268條多態性條帶，多態性條帶比率為82.5%；每個引物組合的總條帶數范圍為3（C8～C1）至17（C1～G3，C2～C1），平 均 值 為8.8；多 態 性 條 帶（PB）從2（C8～C1，C8～C2，C3～G4）到16（C2～C1，C1～G3），平 均 值 為7.2；多 態 性 條 帶 比 率（PPB）為50%（C3～G4）至100%（C5～C4，C1～G5，C8～G2），平均值為79.9%；預期雜合度（He）的值為0.39（C8～C1）至0.89（C5～G1，C7～C2），平均值為0.73；多態性信息含量（PIC）的范圍是0.34（C8～C1）至0.88（C5～G1，C7～C2），平均值為0.69，表明本研究的40個紫花苜蓿標準品種具有豐富的遺傳多樣性。根據上述數據和結果，引物組合C2～C1、C1～G3同時具有較大的TB、PB和PPB；引物組合C5～G1、C7～C2具有最大的He和PIC；引物組合C1～G3在PPB、He、PIC等方面優于大部分其他引物，He和PIC值分別為0.87和0.86。在苜蓿遺傳多樣性分析和品種鑒定中引物對C5～G1、C7～C2和C1～G3表現更好，潛力更大。

圖2 部分IRAP引物在編號1～40的苜蓿品種中擴增結果Fig.2 IRAP amplification results of alfalfa varieties coded from 1 to 40 with part of primers

表4 37對多態性IRAP標記引物信息Table 4 Information of 37 pairs of polymorphic IRAP marker primers

采用37對核心多態性引物組合對40個品種進行分析，擴增出特征譜帶，即僅用1個特征引物即可將品種區分開。在篩選出的引物組合中，每對多態性引物分別能擴增出2～16條多態性條帶（表4）。不同的引物組合能夠區分不同的苜蓿品種（1～7個），部分引物組合一次只可鑒定出一個品種，引物組合C2～C1能夠擴增出16條多態性條帶，可一次性區分7個品種。不同的引物對進行組合可鑒定出高于單個引物組合的更多品種，大大提高對不同品種的鑒別能力。利用37對多態性引物組合在40個紫花苜蓿品種的電泳帶型對引物間擴增結果的相關性進行分析［29］。分析結果如圖3所示，37對引物組合間，C3～G4與C6～G4之間相關性最高，相關系數達到0.95，代表兩者之間擴增帶型最相似，差異最小；C2～C1與C2～G2、C2～G4之間相關性最差，相關系數均為—0.31，表明C2～C1與兩者之間帶型差異最大；C2～C1與C4～G1、C5～C1、C6～C3之間相關性系數也達到—0.30，帶型差異也很大。因此，根據各個引物組合間相關系數以及擴增結果相關性，可以進一步輔助優化不同品種間鑒定的引物選擇和組合，即利用相關性較差的引物組合更加利于進行品種間的鑒定。

圖3 IRAP引物擴增結果相關性分析Fig.3 The correlation analysis based on the IRAP productions

2.3 遺傳相似系數聚類分析

根據37對IRAP多態性引物的擴增結果建立了1與0形式的數據矩陣，利用NTSYSpc 2.1軟件錄入各品種間遺傳相似系數。通過UPGMA聚類分析，以遺傳相似系數為基礎構建了40個苜蓿品種的聚類分析圖（圖4）。根據聚類結果，相似系數以0.82為閾值可以將40個苜蓿品種分為4個主簇聚類（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ）和兩個亞簇聚類（Ⅱ-Ⅰ和Ⅱ-Ⅱ），所有品種均可區分。Ⅰ主簇具有8個種質；Ⅱ主簇有23個種質并分為兩個亞簇，Ⅱ-Ⅰ子類包括全部來自中國的12個種質，Ⅱ-Ⅱ子類包含來自國外的11個種質［包括美國（4）、奧地利（2）、沙特阿拉伯（2）、英國（1）、波蘭（1）、墨西哥（1）］；Ⅲ主簇具有6個種質均來自國外［美國（3）、法國（2）、危地馬拉（1）］；Ⅳ主簇僅具有3個種質，均來自美國。從聚類分析圖中可知，國內20個品種均聚集在Ⅰ主簇和Ⅱ-Ⅰ亞簇，國外20個品種聚集在Ⅱ-Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ簇。聚類分析結果表明，品種間的遺傳基礎較為狹窄，遺傳距離較接近，相似系數較高；地理起源相同的品種具有相似的遺傳背景；品種CUF101、Trifecta、新疆大葉分別各自聚為一子類，表明品種間遺傳背景較遠，多樣化程度較高。如選取同一類群的苜蓿品種（系）進行雜交選育，成功率較低，可能很難達到期望水平。但選取2個不同類群的苜蓿品種進行雜交選育，成功率較高，可能會大大縮短優良品種的選育進程。同時，本研究也表明IRAP分子標記方法適于紫花苜蓿種質資源的親緣關系分析、鑒別及育種遺傳距離的判定等相關研究。

圖4 苜蓿IRAP標記UPGMA聚類分析Fig.4 The UPGMA cluster analysis of IRAP marker in alfalfa

2.4 群體結構分析

STRUCTURE是一種類似于主成分分析（principal component analysis，PCA）和進化樹的方法，使用分子標記的基因型信息對一組樣本進行分類［30］。使用IRAP數據對40個苜蓿品種進行了結構分析。所有K值的簇數（K）為1到11，并且該操作重復20次。當K設置為3時，獲得最高概率（圖5A），最大ΔK出現在K＝3處（圖5B），之后ΔK值隨K的增加而降低，并且當K＞3時再未觀察到ΔK的峰值（圖5B）。ΔK為54.06，代表3個亞群（圖5C），圖5D顯示了在K＝3時的條形結構圖。在K＝3時，苜蓿品種大致分為國內品種和國外品種，結構分類圖表明這些紫花苜蓿材料結構組成來源廣泛，遺傳背景復雜，亞類間有基因交流。藍色組是最大的組，由國內品種（中國）組成；綠色和紅色組主要由國外品種組成，UPGMA聚類結果與STRUCTURE分類結果基本一致。

圖5 苜蓿IRAP標記STRUCTURE分析Fig.5 STRUCTURE analysis of IRAP markers in alfalfa

3 討論

IRAP標記作為LTR反轉錄轉座子分子標記的一種，可檢測在宿主基因組中的反轉錄轉座子插入多態性，易于操作，不需要進行酶切及引物銜接子等繁瑣過程，因此成為應用較廣泛的LTR標記之一［31］。先前研究表明在馬鈴薯（Solanum tuberosum）全基因組LTR轉座子分析中，平均長度為786 bp［32］，本研究中蒺藜苜蓿全基因組水平上LTR序列信息中反轉錄轉座子LTR的平均長度為2605 bp，遠超過馬鈴薯中LTR平均長度，并且在各個染色體上均有分布。反轉錄轉座子的大小隨植物種類的不同和反轉錄轉座子類群的差異而變化很大，反轉錄轉座子兩側翼具有長末端重復序列（LTR），其長度從100 bp到5000 bp不等，在植物中拷貝數多，且散布于各染色體，非常有利于分子標記的開發。不同的物種具有不同的LTR—RT組成：在擬南芥中Gypsy與Copia元素的比例為1.5∶1［33—34］；蒺藜苜蓿中Gypsy與Copia元素的比例為1.1∶1；低于玉米（Zea mays）（1.6∶1）和高粱（Sorghum bicolor）（3.7∶1）［35］，但與大豆（1.4∶1）接近［33］。另外，研究表明，基于LTR—RT開發設計的引物可用于密切相關的屬［6］。先前在豆科植物中運用的IRAP引物是基于早先在百脈根（Lotuscorniculatus）（LORE1、LORE2）和豌豆（Tps12a和Tps19）豆科植物RTN家族設計［33—34］，但由于不同物種的遺傳特異性，LTR反轉錄轉座子分子標記的開發需要依賴物種全基因組序列信息，因此目前尚未有基于豆科植物LTR分子標記開發和應用的相關報道。本研究在蒺藜苜蓿全基因組水平上開發了431個LTR引物，進而用于評價與其近緣關系最為接近的紫花苜蓿種質資源。

品種的遺傳多樣性分析著眼于揭示品種的遺傳關系和遺傳基礎，部分引物可以直接區分某些紫花苜蓿品種。本研究中，IRAP標記能擴增出多態性高、清晰、品種間有差異的帶型。Branco等［36］利用22個IRAP標記在51份水稻種質中擴增出156條多態性條帶；Holasou等［11］利用9個IRAP標記評價49份小麥種質擴增出74條多態性條帶；Carvalho等［37］利用5個IRAP標記在48份小麥種質中擴增出103條多態性條帶；Mandoulakani等［12］利用10個IRAP引物組合評價8個種群80個紫花苜蓿基因型，擴增出66條多態性條帶，多態性條帶比率為65.3%。本研究篩選出的37對多態性引物，相比于其他物種，IRAP標記成功擴增出更多的多態性條帶（268）以及較高的平均多態性條帶比率（79.9%）。在多態性引物擴增結果中只要一個品種之間的一個DNA基因座（片段）的基因型（帶型）不同，就可以認為是不同的品種；篩選出核心引物，可以使用不同的DNA條帶型以及相關性較低的引物組合來區分更多的品種。在本研究中引物的PIC平均值為0.69，其中有19個（51.35%）引物的PIC＞0.7，18個（48.65%）引物的PIC值范圍為0.34～0.69。研究表明當PIC值大于0.7可用于構建遺傳圖譜［38］，表明基于LTR開發多態性IRAP分子標記在遺傳多樣性和遺傳圖譜分析中具有較大的潛力。

聚類分析指將物理或抽象對象的集合分組為由類似的對象組成的多個類的分析過程，它已成為牧草育種的必要手段之一。在IRAP聚類分析中，多態性引物擴增結果在同樣的閾值條件下，能夠在品種間更好地將全部供試材料分成4大主簇，以及更細更具體的類群，從而更容易區分國內外40份紫花苜蓿種質資源的遺傳多樣性。利用內含子長度多態性（intron-length polymorphic，ILP）分子標記對21份紫花苜蓿種質資源的分類研究中，甘農4號、公農2號與國外品種被分在同一主簇；甘農3號單獨分在一主簇，無法將國內外品種具體區分［16］。而本研究開發出的IRAP標記多態性引物組合能夠將國內外種質資源進行區分，同時也將國內各個品種進行了更加具體的分類。紫花苜蓿品種的STRUCTURE分析中顯示出各個集群包括國內外品種的混合，造成結構混合的原因有很多：例如，所有這些基因型都包含一定程度的相同等位位點，基因交流程度，異花授粉或祖先的常見遺傳成分。大部分苜蓿品種是通過表型輪回選擇或大量自然選擇栽培的綜合品種，多個親本參與雜交，導致部分繁殖品種之間的系統發育構成有著或多或少的關聯。不同品種間遺傳變異程度不一致，可為紫花苜蓿品種改良提供豐富、優良的親本條件，該研究結果比經驗性的直觀分類結果更準確可靠。因此，從整體來看，IRAP分子標記得到的多態性條帶數目更多、更穩定、多態性條帶比率高，更易揭示不同品種的遺傳差異，可將紫花苜蓿種質更科學、更系統地分類，在紫花苜蓿種質資源遺傳多樣性研究上有重要的應用價值。

4 結論

本研究通過蒺藜苜蓿全基因組信息設計IRAP引物用于紫花苜蓿品種鑒別和種質資源分析。以37對核心多態性引物組合構建了40份紫花苜蓿品種的遺傳多樣性分析和品種鑒別體系。從分子水平快速準確鑒別和分析苜蓿品種遺傳多樣性，擴增譜帶在品種中具有豐富的多態性，能較好地將不同品種區分開，為合理利用紫花苜蓿種質資源的分類、品種識別、選配優良雜交組合培育新品種提供理論依據。