水產(chǎn)苗種中硝基呋喃類代謝物的快速測定

張倩玉，李達(dá)，牟丹丹，魏海英，王磊

（日照市海洋與漁業(yè)研究院，山東 日照 276800）

硝基呋喃類藥物是一種廣譜抗生素，其抗菌效果顯著，價格低廉，曾被廣泛用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)[1]。但由于硝基呋喃類藥物及其代謝物有嚴(yán)重的致癌、致畸等毒副作用[2]，已被我國禁止在畜禽及水產(chǎn)動物食品中使用。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《2020年食用農(nóng)產(chǎn)品市場監(jiān)管部門抽檢不合格情況分析匯總》顯示，水產(chǎn)品類食用農(nóng)產(chǎn)品中呋喃西林代謝物檢出113 批次，呋喃唑酮代謝物檢出40 批次。說明市場上仍存在違規(guī)使用硝基呋喃類藥物的問題。

硝基呋喃類藥物在動物體內(nèi)的半衰期很短，被迅速代謝為與蛋白質(zhì)結(jié)合的代謝物，可長期穩(wěn)定存在于動物體內(nèi)[3]。有些水產(chǎn)品中檢出硝基呋喃類藥物，是由于在水產(chǎn)苗種期使用了此類禁用藥物。因此加大對水產(chǎn)苗種藥物殘留的檢測，可從源頭上控制違規(guī)使用藥物。

硝基呋喃類藥物主要包括呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃妥因和呋喃他酮。在動物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物依次為氨基脲（SEM）、3-氨基-2-惡唑烷基酮（AOZ）、1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD）和5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ），通常通過測定這4 種代謝物的含量來評估其在動物體內(nèi)的殘留情況。硝基呋喃類代謝物常用的檢測方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]、酶聯(lián)免疫法[5]和液相色譜法[6]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量和定性測量準(zhǔn)確，靈敏度高，為檢測硝基呋喃類代謝物的首選方法?，F(xiàn)對文獻(xiàn)[7]的測定方法進(jìn)行改進(jìn)，用于水產(chǎn)苗種中硝基呋喃類代謝物殘留量快速檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 1260/6460A）、臺式高速離心機(jī)、渦旋混合器、水浴氮吹儀、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電子精密天平、固相萃取裝置、超純水儀等。

甲醇、乙酸乙酯、正己烷（色譜純，美國ACS）；2-硝基苯甲醛（＞99.0%，日本東京化成工業(yè)）；乙酸銨（色譜純，天津科密歐）；甲酸（色譜純，美國ROE）；二甲亞砜、磷酸氫二鉀、鹽酸均為分析純（國藥集團(tuán)）；Waters Oasis HLB 固相萃取柱。

標(biāo)準(zhǔn)品：AOZ、AMOZ、SEM·HCl、AHD·HCl（德國Dr. Ehrenstorfer），AOZ-D4、AMOZ-D5、SEM·HCl-13C-15N2、AHD-13C3（德國Witega），純度均＞98%。標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成質(zhì)量濃度為200 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，并用水逐級稀釋配成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于4 ℃冷藏保存。

1.2 樣品前處理

海參、牙鲆、許氏平鲉、鯉和鯽苗種均取自日照當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖場，取樣及制樣方法依據(jù)文獻(xiàn)[8]。

1.2.1 水解及衍生化

稱取均質(zhì)樣品2.00 g 于50 mL 離心管中，依次加入0.05 mL 100 μg/L 混合內(nèi)標(biāo)工作溶液、5 mL 0.2 mol/L 鹽酸溶液和0.15 mL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛，渦旋混合50 s 后，超聲10 min，置于60 ℃恒溫培養(yǎng)箱中衍生4 h。

1.2.2 提取凈化

取出離心管，冷卻至室溫，加入適量1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液，調(diào)節(jié)pH 值為7.0～7.5。

海參苗種及體長大于8 cm 的魚苗樣品：加入8 mL 乙酸乙酯，渦旋混合 50 s，4 000 r/min 離心5 min。上清液轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，于40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?。?zhǔn)確加入1 mL 初始流動相和2 mL正己烷溶解殘留物，渦旋混合50 s，6 000 r/min 離心 5 min，取下層過 0.22 μm 濾膜，待測。

體長小于8 cm 的魚苗樣品：4 000 r/min 離心5 min；上清液轉(zhuǎn)移至25 mL 離心管中，加入5 mL正己烷，渦旋 1min，6 000 r/min 離心 5 min；棄去上層正己烷，下層倒入預(yù)先活化的HLB 固相萃取柱。待樣液全部通過固相萃取柱后，用10 mL 水洗滌固相萃取柱，減壓抽干。用5 mL 乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，于40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1 mL 初始流動相，渦旋混合 50 s，過 0.22 μm 濾膜，待測。

1.3 液相色譜及質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18 柱，2.1 mm×50 mm，粒度 1.8 μm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流量：0.3 mL/min；流動相 A：2 mmol/L 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）；流動相B：甲醇（0.1%甲酸），流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：ESI+；干燥氣溫度：325 ℃；干燥氣流量：12 mL/min；霧化器壓力：314.33 kPa；毛細(xì)管電壓：4 000 V，其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測離子對及質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理優(yōu)化

2.1.1 衍生化條件

硝基呋喃類代謝物相對分子質(zhì)量為75~201，離子化效率較低，因此需要通過衍生化反應(yīng)增大代謝物分子質(zhì)量來提高檢測靈敏度。文獻(xiàn)[7]中衍生反應(yīng)條件是采用37 ℃恒溫水浴振蕩16 h，時間較長?，F(xiàn)通過提高衍生反應(yīng)的溫度來縮短測定的時間。根據(jù)文獻(xiàn)[9]，將衍生溫度提高到60 ℃，反應(yīng)4 h。該衍生條件下，4 種硝基呋喃類代謝物的檢出限、工作曲線的線性方程及相關(guān)系數(shù)（表3），均能滿足測定要求。

2.1.2 凈化方法優(yōu)化

文獻(xiàn)[7]中，樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，氮?dú)獯蹈蓾饪s之后直接甲醇定容上機(jī)測定。但在用乙酸乙酯提取目標(biāo)物的同時，樣品基質(zhì)中的脂肪等脂溶性物質(zhì)也會進(jìn)入乙酸乙酯層，可能會使質(zhì)譜背景信號增大，進(jìn)而影響測定的靈敏度。此外，脂類物質(zhì)可能會滯留在色譜柱內(nèi)，影響色譜柱的使用壽命。因此，有必要對上機(jī)前不同的樣品基質(zhì)采用不同的凈化方法。魚苗樣品因規(guī)格的不同，制樣方法存在差異：體長＞8 cm 的魚苗樣品需要去頭、鱗、骨，取肌肉、內(nèi)臟等部分絞碎；而體長＜8 cm 的魚苗樣品需要整條絞碎后測定，后者的基質(zhì)要比前者復(fù)雜。因此對于體長＜8 cm 的魚苗樣品，經(jīng)正己烷去脂之后，需過固相萃取柱，以提高凈化效果。

2.2 方法靈敏度及線性范圍

在上述色譜和質(zhì)譜條件下，依次測定濃度為0.5，1.0，2.5，5.0，10.0 和 20.0 μg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物的濃度比為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，4 種硝基呋喃類代謝物的線性方程及線性相關(guān)系數(shù)見表3。由表3 可見，4 種硝基呋喃類代謝物為0.5~20.0 μg/L，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均＞0.999。方法檢出限以3 倍信噪比（S/N）估算，AMOZ 和 AOZ 的檢出限為0.1 μg/kg，AHD 和 SEM 的檢出限為 0.2 μg/kg，均高于文獻(xiàn)[10]限量值 1.0 μg/kg。

表3 4 種硝基呋喃代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.3 方法回收率及精密度

在2 g 牙鲆苗種陰性樣品中，分別添加1.0，2.5和5.0 μg/kg 3 個水平混和標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個加標(biāo)水平平行測定6 次，考察回收率及精密度，結(jié)果見表4。由表4 可見，回收率為90.0%~104.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10%，該方法完全滿足國標(biāo)要求[11]。

表4 方法回收率和精密度（n=6）

3 結(jié)論

對文獻(xiàn)[7]的測定方法進(jìn)行了改進(jìn)，優(yōu)化了衍生條件，通過提高衍生溫度縮短了前處理時間。此外，還針對不同樣品基質(zhì)優(yōu)化了凈化方法。優(yōu)化后的方法較文獻(xiàn)[7]的測定方法更為快速，且靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于水產(chǎn)苗種中硝基呋喃類代謝物的快速測定。