環介導等溫擴增技術檢測四翼無刺線蟲方法的建立*

黃 健 馮育芳 邢 進 魏 杰 李曉波 岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 102629)

四翼無刺線蟲是小鼠常見的體內寄生蟲，是實驗動物蠕蟲檢測項目中陽性率較高的，常造成群體大范圍傳染[1]。因該線蟲與隱匿管狀線蟲形態特征近似，不易分辨，對日常檢測造成一定困難。目前，該項目常用的檢測方法是依靠形態學進行顯微鏡肉眼檢測，分子生物學的PCR方法已有報道。但形態學檢測需要檢測人員經過寄生蟲形態學系統培訓達到一定經驗要求，PCR方法需要高技能人員和精密的熱循環和電泳設備，通常在基層檢測中難以應用[2]。因此，建立一種方便、快捷的檢測方法，對于四翼無刺線蟲的檢測十分有必要。

環介導等溫擴增方法(loop—mediated isothermal amplification，LAMP)是一種體外核酸擴增技術[3]，可作為PCR的另一種替代方法，依靠識別目標序列中特定的6個區域，設計內部引物(FIP、BIP)和外部引物(F3、B3)[4]。此外，LAMP檢測不需要昂貴的熱循環設備，僅在恒溫條件下進行擴增[5]，即可進行簡單的視覺檢測對結果進行驗證，特異性和敏感性強，效率高、擴增速度快。現已應用于病原微生物的日常檢測中[6]。

本研究針對四翼無刺線蟲設計一種基于環介導等溫擴增方法對基因組DNA進行檢測，目的是能為基層實驗室提供一種快速診斷的新方法。

1 材料和方法

1.1 實驗樣本

四翼無刺線蟲和鞭毛蟲樣本均來自本實驗室日常檢測的實驗動物，以實驗動物使用的“3R”原則為依據，經安樂死處死后，取腸內容物收集四翼無刺線蟲和鞭毛蟲樣本。

1.2 主要試劑與儀器

微量基因組DNA、糞便DNA提取試劑盒(OMEGA公司)；DNA Marker、瓊脂糖、RNase-free Water(TaKaRa公司)；DNA-LAMP擴增反應試劑盒、LAMP熒光檢測試劑盒【榮研生物科技(中國)有限公司】。

1.3 基因組DNA的提取

四翼無刺線蟲基因組DNA：取單條蟲體，按試劑盒說明提取DNA，保存于-20 ℃冰箱。鞭毛蟲基因組DNA：取少于2 mg的糞便，按試劑盒說明提取DNA，同樣保存于-20 ℃冰箱，備用。

1.4 LAMP擴增反應方法建立

1.4.1LAMP引物設計和合成：參照NCBI GenBank中四翼無刺線蟲398 bp DNA序列(登錄號MG386202.1)，使用在線軟件PrimerExplorer V5 設計LAMP引物，FIP:5’-CCTTAATACCAGTAGGAAC AGCAATTTTTGATATGAGGACTCGTTTG-3’，BIP：5’-TGGTAGTAATATGGTGTTTCAGCCTAATACCAGTTAAA CCCCCTAA-3’，F3：5’-GGTCATCATATGTTTACTGT GG-3’，B3：5’-CCAAAACAGGA TTAGCAACC-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.2LAMP反應體系及結果判定：25 μL LAMP反應體系為：2×反應液(含40 mmol Tris-HCL，pH 8.8)，20 mmol KCL，16 mmol MgSO4，20 mmol (NH4)2SO4，0.2% Tween20，125 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，100 μmol內引物FIP和BIP各0.4 μL，100 μmol外引物F3和B3各0.1 μL，Loopamp熒光目測檢測試劑(FD)1 μL，模板DNA 2 μL，加RNase-free Water至25 μL。移液器吹打混勻后，放入恒溫金屬浴62 ℃恒溫反應60 min，最后80 ℃滅活5 min。取出觀察有無顏色變化，當發生擴增反應時，呈綠色為陽性反應，橙色為陰性反應。取2 μL LAMP擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.5 特異性實驗

應用試劑盒提取四翼無刺線蟲和鞭毛蟲基因組DNA，分別對四翼無刺線蟲和鞭毛蟲基因組DNA、ddH20進行LAMP擴增實驗，觀察熒光顯色情況和對LAMP擴增產物進行電泳，觀察擴增結果。

1.6 敏感性實驗

將四翼無刺線蟲基因組DNA以 10倍梯度稀釋，分別為2.8～2.8×105ng/μL共6個梯度。取2 μL DNA加入LAMP反應體系，進行LAMP擴增反應。

2 結果

2.1 LAMP檢測結果

四翼無刺線蟲DNA擴增產物呈現綠色(陽性)，電泳后出現特征性的梯度條帶。對照反應管為棕色(陰性)，電泳未顯示條帶。

2.2 LAMP反應特異性驗證

特異性實驗結果見圖1，只有四翼無刺線蟲基因組DNA的LAMP產物呈現強烈的綠色，ddH2O和鞭毛蟲基因組DNA出現棕色。擴增后產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，四翼無刺線蟲基因組DNA可擴增出典型梯度條帶，其余對照均未出現條帶(圖2)。

1.鞭毛蟲；2.水；3.四翼無刺線蟲1.Giardia lamblia;2.ddH2O;3.aspiculuris tetraptera圖1 特異性實驗結果Fig.1 The specificity test

M.100 bp DNA Ladder Marker；1.四翼無刺線蟲；2.鞭毛蟲；3.水M.100 bp DNA Ladder Marker；1.Aspiculuris tetraptera；2.Giardia lamblia；3.ddH2O圖2 LAMP產物瓊脂糖凝膠電泳結果(特異性)Fig.2 Results of LAMP amplification products byAgarose gel electrophoresis(specificity test)

2.3 LAMP反應敏感性驗證

將四翼無刺線蟲DNA模板10倍梯度稀釋10～105倍共5個濃度，LAMP擴增產物的綠色熒光顯示，LAMP反應的擴增水平可擴增出102倍的稀釋DNA(圖3)，與瓊脂糖凝膠電泳結果一致(圖4)。

1～6.原液～105倍稀釋；7.鞭毛蟲；8.水1～6.Crude solution～105 times dilution;7.Giardia lamblia;8.ddH2O圖3 敏感性實驗結果Fig.3 The sensibility test

M.100 bp DNA Ladder Marker；1～6.原液～105倍稀釋；7.鞭毛蟲；8.水M.100 bp DNA Ladder Marker;1-6.Crude solution-105times dilution;7.Giardia lamblia;8.ddH2O圖4 梯度稀釋DNA LAMP產物瓊脂糖凝膠電泳結果(敏感性)Fig.4 Results of LAMP amplification products byGradient dilution of DNA (sensibility test)

3 討論

四翼無刺線蟲(Aspiculuristetraptera)是蠕蟲的一種，屬于線蟲綱(Nematoda)，尖尾目(Oxyurida)，異線科(Heteroxynematidae), 無刺屬(AspiculurisSchulz)，又稱蟯蟲[7]。該種線蟲在全球各地均有報道，并且在實驗室的實驗鼠中經常被檢測到，在中國《實驗動物 寄生蟲學等級及監測》國家標準(GB 14922.1—2001)和其他國實驗動物檢測標準中，均是應排除的寄生蟲之一。實驗鼠感染蟯蟲后，對實驗的準確性和可靠性將會產生影響，因此必須對鼠蟯蟲病的篩查給予重視。

目前，四翼無刺線蟲常用的檢測方法是依靠形態學進行顯微鏡肉眼檢測，PCR方法已有報道。但形態學檢測需要檢測人員經過寄生蟲形態學系統培訓達到一定經驗要求，PCR方法需要高技能人員和精密的熱循環和電泳設備，實驗結果假陽性較高[8]。與傳統PCR檢測法相比，LAMP檢測法操作簡便，因其為等溫反應，可省去熱循環擴增，不需要PCR儀，操作極為簡便[9]；耗時短，LAMP反應體系可在恒溫條件下擴增，僅耗時1 h左右，即可根據肉眼觀察的綠色熒光情況對LAMP產物的擴增情況進行結果判定，其擴增產物經電泳后，出現特征性的階梯狀條帶，不會出現雜帶而干擾結果的判斷；經過熒光顯色法和瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果一致，因此，可選用熒光顯色法作為LAMP法的結果判定。可避免因開蓋電泳造成污染形成的假陽性結果[4]。

可見，四翼無刺線蟲的LAMP擴增反應具有簡便、快速、特異性強、靈敏度高的特點。作為一種快速診斷的新方法為基層實驗室和現場檢測工作提供新的檢測參考依據，為四翼無刺線蟲的檢測提供了一種新思路和新方法。