自發性先天性白內障大鼠毛色基因型鑒定*

董 敏 尤金煒 梁 磊 吳正林 田小蕓

(南京大學醫學院附屬金陵醫院實驗動物室，南京 210002)

遺傳上的高度純合是對近交系動物的基本要求。根據國家標準，新建立的近交系需進行相應的遺傳檢測，國際上通用的遺傳檢測方法很多，其中毛色基因檢測法是遺傳監測的重要方法之一[1]。自發性白內障大鼠由本中心培育，經過10多年的連續近交繁殖，現已培育至第31代，暫定名為自發性先天性白內障大鼠(TSC)大鼠，理論上已經達到基因高度純合，符合近交系動物的近親繁殖代數要求，且具有自身獨特的生物學特征[1]。本實驗組已經對TSC大鼠各生理指標作了相應的檢測與分析，已經做了晶狀體的病理學研究、繁殖性能及生長發育實驗、血液生化及血液流變學指標、臟器重量及系數以及血壓與體溫基礎數據分析。另外，為了監測TSC大鼠的基因純合度和遺傳穩定性，我們對其毛色基因類型進行了測試，確定了其基因類型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

1.1.1待測TSC大鼠：由東部戰區總醫院實驗動物室提供，來自基礎群的TSC大鼠，6～8周齡，體質量180～200 g，雌雄各半，毛色為白色，實驗動物生產許可證號【SCXY(軍)2017-0018】。

1.1.2已知復隱性基因大鼠：F344大鼠及BN大鼠由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供【SCXK(滬)2018-0006】。其毛色及基因型分別為白色(aaBBcc)和巧克力色(aabbCC)。

1.2 飼養管理及環境

實驗大鼠均飼養在屏障環境中，室內的溫濕度均由中央空調控制，溫度為20～26 ℃，相對濕度為50%～70%，采用12 h∶12 h晝夜間斷照明。使用許可證號【SYXK(軍)2017-0037】。大鼠飼料為60Co輻射飼料，生產許可證號【蘇飼審(2019)01008】，營養成分執行標準：Q/320115XT04-2019。飲水為消毒的酸化水，使用的墊料、盒子等用具均進行131 ℃ 5 min高壓預真空滅菌。飼養由持證上崗具有大專及以上文化的熟練技師負責。

1.3 實驗方法

1.3.1方法：將待測基因型的TSC大鼠雄性分別與已知基因型的F344大鼠及BN大鼠雌性按1∶2交配，同時將待測基因型的TSC大鼠雌性分別與已知基因型的F344大鼠及BN大鼠雄性按1∶2交配，每組7窩，生產后兩周觀察F1代仔鼠毛色，觀察時間1～2周。再通過TSC與BN大鼠的F1代與親本BN大鼠按1∶2回交，每組7窩，生產后觀察仔鼠1～2周。通過以上已知復隱性親本F344大鼠及BN大鼠的基因型、F1代大鼠的毛色基因表現型及F1代與親本BN大鼠回交毛色基因型，綜合判斷TSC大鼠毛色基因的基因型。

1.3.2判斷結果要求：純系大鼠后代毛色應完全一致。出現異色者(如毛色變黃、腹印等)，即為不純；被測品系用于交配的雌雄動物數均不少于7只，每個個體后代仔鼠觀察數不少于7只。

2 結果

2.1 用已知復隱性基因的F344大鼠及BN大鼠與待測基因型的TSC大鼠相互交配

TSC大鼠與BN大鼠雜交，無論雌雄，其F1代所觀察的大鼠毛色均呈一致的巧克力色，見圖1 F1代B位點為Bb基因。TSC大鼠與F344大鼠雜交，無論雌雄，其F1代所觀察的大鼠毛色均呈一致的白色，見圖2，可能為白色隱性上位，說明其沒有C基因，具體見表1。

圖1 TSC與BN雜交F1Fig.1 F1 Hybridization of TSC and BN

圖2 TSC與F344雜交F1Fig.2 F1 Hybridization of TSC and F344

圖3 圖1中雜交F1與TSC回交Fig.3 Backcross of TSC with F1 generation in Figure 1

表1 F1代仔鼠的毛色表型Table 1 Hair color phenotype of F1 generation

2.2 用TSC大鼠與BN大鼠雜交的F1代與TSC大鼠回交

TSC大鼠與BN大鼠雜交的F1代與TSC大鼠回交后，仔鼠出現黑、白、花色(圖3)，初步推斷F1代A位點為Aa基因，根據以上信息，推測TSC大鼠與BN大鼠F1代基因型為AaBbCc，具體見表2。

表2 F1代與TSC大鼠回交的毛色表型Table 2 Hair color phenotype of F1 generationbackcrossed with TSC rats

2.3 根據已知復隱性親本的基因型及F1代仔鼠毛色表現型，對TSC大鼠毛色基因結果作出判斷

已知復隱性基因大鼠BN大鼠(巧克力色)基因型為aabbCC，F1代基因型為aaBbBc，由此推測待測白內障大鼠TSC的基因型為aaBBcc。

3 討論

3.1 控制毛色的基因分析

控制毛色的基因很多，受ABC 3個位點支配。A位點上基因所控制的是每根毛中色素的分布，基因A對a顯性。基因型是AA或Aa時，色素在毛尖或根部含量高，中部少。基因為aa時，色素在毛中沉著均勻一致。B位點上基因與黑色素合成有關，基因B對b顯性，基因型是BB或Bb時，可合成黑色色素，bb時合成褐色色素。A、B位點可組合成4種基本毛色：A-B為野生色；aaB為黑色；Abb為肉桂色；aabb為棕色[2-3]。C位點上基因與被毛毛色形成有關，基因C對c顯性，基因型為CC或Cc時，被毛均為有色，基因型為cc時，被毛為白色，眼為紅色。C位點具有隱性上位作用，當基因型為cc時，A、B位點無論怎樣組合，被毛顏色均為白色[4-5]。

3.2 關于TSC大鼠的毛色基因位點純合度和毛色基因型

TSC大鼠是由本單位在屏障環境SD大鼠生產的仔鼠中發現的5只先天性白內障大鼠，經過10多年近交繁育的新近交品系，已培育至第31代，暫命名為TSC大鼠，理論上已經達到基因高度純合。本實驗中，TSC大鼠與F344大鼠交配時，所生F1代顏色均為白色，初步推斷C位點為cc，不含C基因。A、B兩個位點尚不能判斷。在TSC大鼠與BN大鼠交配所生的F1代仔鼠中，14窩仔鼠毛色均為巧克力色，已知BN大鼠基因型為aabbCC，結合前面結果，初步判斷，F1代仔鼠B位點為Bb，C位點為Cc。根據其F1代與TSC大鼠回交，仔鼠出現黑色、白色、花色(圖3)，初步推斷其F1代A位點為Aa，根據以上判斷，其F1代基因型應該為AaBbCc，因此證明TSC大鼠毛色基因為AABBcc。

在測試中，雌或雄性TSC大鼠分別與BN、F344大鼠雜交或回交，其F1代仔鼠毛色表型均為均一色，本次測試結果結合項目組前期做的晶狀體病理學研究、繁殖性能及生長發育實驗、血液生化及血液流變學指標、臟器重量及系數以及血壓與體溫基礎等數據分析結果[6-10]，說明TSC大鼠毛色基因純合度均達100%，遺傳純合度已達國家標準，是毛色基因位點高度純合的自發性先天性白內障大鼠模型。