慢性應激聯合孤養對自發性高血壓大鼠行為學、血清中5-HT與海馬區神經元的影響*

陳 蕾 劉葉倩 趙紅霞 李 弘 吳碧茹 曾 勇 馬丹鳳 陳春茗 劉 林 任衛瓊 易 健

(1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 410007)(2.安徽省第二人民醫院，合肥 230041) (3.湖南中醫藥大學科技創新中心，長沙 410208)(4.湖南省兒童醫院，長沙 410007)

近10年來，我國高血壓患病人數高達3.3億，該病并發癥多，可以造成心、腦、腎和血管等全身多個靶器官不同程度的損害[1-2]。患抑郁癥的概率為26%，其中男性24.6%，女性24.4%[3]。研究表明，其并發的抑郁癥是高血壓患者死亡的重要危險因素[4]，且高血壓病程越長，抑郁程度越深，兩者相互促進[5]。

高血壓并發抑郁癥(hypertension complicated with depression，HD)的發生主要是長期的高壓狀態造成的情緒失調及長期服用降壓藥物致使的心理負擔加重，誘發情感障礙，導致并發抑郁癥[6]。目前，與HD有關的研究大多集中于臨床，主要是因為缺乏系統、規范且符合病證特點的HD動物模型及相關評價體系。故本實驗采用慢性不可預知溫和應激聯合孤養的方法觀察自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)行為學、血清中5-HT及海馬神經元的變化，以支持進一步研究一種相對可靠的高血壓并發抑郁癥動物模型。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物： 自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK(京)2016-0006】采購20只8周齡SPF級健康雄性SHR大鼠，體質量180～220 g；10只8周齡SPF級健康雄性SD大鼠，體質量180～220 g，質量合格證編號：110011211102924524；以上實驗動物飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學創新中心實驗動物中心【SYXK(湘)2020-0003】，本實驗由湖南中醫藥大學動物倫理委員會審查，倫理審批號：2YFY20210316-01。飼養環境燈光12 h循環，室溫恒定22～ 24 ℃，濕度55%～65%，大鼠自由攝取食物與水。

1.1.2主要試劑與儀器： 生理、藥理電子刺激儀(YLS-9A型，濟南益延科技有限公司)；智能無創血壓計(BP-98A，北京軟隆生物有限公司)；組織脫水機(STP-120，Thermo Fisher)；包埋機(HistoStar，Thermo Fisher)；染色機(Gemini AS，Thermo Fisher)；病理組織漂烘儀染色機(PH60型，常州派斯杰有限公司)；熒光顯微鏡(BX43，Olympus)；酶標儀(MK-3，Thermo Fisher)；5-HT酶聯免疫試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司)；Nissl 染色液(DK0023，北京雷根生物有限公司)；蘇木精-伊紅染色試劑盒(北京九州柏林生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組、造模：SHR 20只，隨機均分為高血壓對照組和模型組，另設同數Sprague-Dawley(SD)大鼠為空白組。模型組以慢性不可預知溫和應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)聯合孤養的方法干預5周，其余組正常飼養。應激包括：(1)噪音刺激4 h；(2)禁水24 h；(3)食物剝奪24 h；(4)晝夜顛倒24 h；(5)潮濕墊料24 h；(6)4 ℃冰水浴4 min；(7)傾籠45°24 h；(8)50 V電擊1 min。每天隨機抽取一種刺激方法進行干預，方法(6)、(8)每周1次，且1周內的干預方法不重復。

1.2.2動物行為學檢測：(1)大鼠一般情況：觀察大鼠毛發的色澤、枯榮，活躍程度、飲食情況、大小便狀態等。記錄各組大鼠造模前體質量為初始值，以每周體質量與初始值之差為變化量，計算變化量與初始值的比值為體質量變化率(%)。(2)血壓測定：使用無創血壓儀，分別于造模前、14、35 d的8:00～12:00測量大鼠尾動脈壓，每只大鼠進行3次測量，記錄平均值。(3)曠場實驗(Open-field test)：將大鼠從敞箱底面中央一格上方背對實驗人員放入，適應 30 s，記錄 4 min。觀察大鼠后肢站立次數與某一肢體穿越格子次數。(4)糖水消耗實驗(sucrose preference test)：禁食禁水24 h，各鼠籠備1%濃度蔗糖水與蒸餾水各一瓶，每瓶200 mL，供大鼠自由飲用，1 h后調換二者位置，2 h后撤除水瓶，記錄2 h內蔗糖水瓶糖水消耗量，計算各組大鼠糖水消耗率(%)。(5)強迫游泳實驗(forces swim test)：將大鼠置入水缸，適應30 s后，記錄大鼠處于自然漂浮狀態的時間，此時大鼠僅露出鼻孔呼吸或四肢輕微擺動保持平衡。

1.2.3樣本采集：實驗結束后，所有動物禁食不禁水12 h，乙醚吸入麻醉，腹主動脈取血，靜置、離心、收集血清，-80 ℃凍存。迅速斷頭取腦，使用0.9%氯化鈉溶液洗去血污，4%多聚甲醛中固定。

1.2.4ELISA法檢測各組大鼠血清中5-HT含量：取出5-HT試劑盒室內平衡溫度30 min，根據內置說明書順序依次操作，酶標儀檢測A值，換算各組大鼠血清中5-HT含量。

1.2.5HE染色觀察海馬組織病理狀態：全腦置4%多聚甲醛溶液固定。取海馬組織脫水、包埋。蠟塊以2 μm切片，烘漂儀脫去石蠟，染色機HE染色，中性樹膠封片。200倍熒光顯微鏡下觀察拍片。

1.2.6尼氏染色觀察海馬神經元凋亡狀態：海馬組織蠟塊以5 μm切片并脫蠟至水，置入染缸。56 ℃溫箱浸染1 h，漂洗去染色液，依次置入分化液、無水乙醇、二甲苯，使用中性樹膠封片，400倍熒光顯微鏡觀察拍片。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠一般情況變化

與空白組比較，高血壓對照組大鼠毛發色澤、枯榮程度，飲食情況，二便狀態無異常，習性活躍，體質量增長率顯著性增大(P<0.05)。與高血壓對照組比較，模型組大鼠毛發色澤暗淡枯槁，精神萎靡，膽小、喜蜷縮拱背，食欲差，二便增加，體質量增長率顯著性降低(P<0.01)，見圖1。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與高血壓對照組比較，#P<0.05，##P<0.01Note：Compared with control group, *P<0.05，**P<0.01;Compared with hypertension control group,#P<0.05，##P<0.01圖1 各組大鼠體質量增長率比較Fig.1 Comparison of body weight growthrate of rats in each group

2.2 大鼠收縮壓變化

造模前、14 d與結束后，與空白組比較，高血壓對照組與模型組大鼠收縮壓顯著性升高(P<0.01)。模型組略高于高血壓對照組，但該差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

注：與空白組比較，*P<0.01；1 mmHg=0.133 kPaNote：Compared with control group, *P<0.01;1 mmHg=0.133 kPa圖2 造模前、14 d、造模結束后收縮壓變化Fig.2 Changes in systolic blood pressure beforemodeling, 14 days, and after modeling

2.3 造模14 d、結束后各行為學結果

2.3.1曠場實驗： 造模14 d后，與空白組比較，高血壓對照組曠場實驗活動次數顯著性增加(P<0.05)，模型組無統計學差異(P>0.05)；此時，模型組活動次數較高血壓對照組略低，但數據無統計學差異(P>0.05)。造模結束后，與空白組比較，高血壓對照組活動次數顯著性增加(P<0.01)，模型組顯著性降低(P<0.05)，此時，模型組活動次數較高血壓對照組顯著性降低(P<0.01)，見圖3。

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與高血壓對照組比較，#P<0.01Note：Compared with control group, *P<0.05，**P<0.01;Compared with hypertension control group,#P<0.01圖3 造模14 d、結束后曠場實驗結果Fig.3 The results of the open field testafter 14 days of modeling

2.3.2糖水偏好實驗： 造模14 d后，3組間糖水消耗率比較無統計學差異(P>0.05)。造模結束后，與空白組比較，高血壓對照組該指標無統計學差異(P>0.05)，模型組糖水消耗率顯著性降低(P<0.01)；與高血壓對照組比較，模型組糖水消耗率顯著性降低(P<0.01)，見圖4。

注：與空白組比較，*P<0.01；與高血壓對照組比較，#P<0.01Note：Compared with control group, *P<0.01;Compared with hypertension control group,#P<0.01圖4 14 d、造模結束后糖水消耗實驗結果Fig.4 Experimental results of sugar water consumptionafter 14 days of modeling and after modeling

2.3.3強迫游泳實驗： 與空白組比較，高血壓對照組不動時間無統計學差異(P>0.05)。與空白組和高血壓對照組比較，模型組大鼠顯著性延長(均P<0.01)，見圖5。

注：與空白組比較，*P<0.01；與高血壓對照組比較，#P<0.01Note：Compared with control group, *P<0.01;Compared with hypertension control group,#P<0.01圖5 造模結束強迫游泳實驗結果Fig.5 Results of forced swimming experiment after modeling

2.4 ELISA測定各組大鼠血清中5-HT的含量變化

與空白組比較，高血壓對照組大鼠血清中5-HT含量無統計學差異(P>0.05)。與空白組和高血壓對照組比較，模型組血清中該指標顯著性降低(P<0.01，P<0.05)，見圖6。

注：與空白組比較，*P<0.01；與高血壓對照組比較，#P<0.05Note：Compared with control group, *P<0.01;Compared with hypertension control group,#P<0.05圖6 各組大鼠血清5-HT含量變化Fig.6 Changes in serum 5-HTcontent of rats in each group

2.5 HE 染色觀察各組大鼠海馬組織病理形態改變

空白組海馬神經元核仁清晰，形態圓整，排列整齊；高血壓對照組部分海馬神經元出現核固縮，細胞萎縮；模型組海馬神經元存在一定程度的損傷，具體表現為神經元細胞核染色加深，胞體固縮，排列疏松，部分細胞凋亡，見圖7。

圖7 HE染色觀察海馬神經元病理變化Fig.7 HE staining to observe the pathological changes of hippocampal neurons

2.6 尼氏染色觀察各組大鼠海馬神經元的凋亡情況

空白組海馬神經元形態完整，尼氏小體數量多且密集；高血壓對照組神經元形態正常，尼式小體數量多；模型組神經元密度降低，胞質著色較淺，尼氏小體減少，見圖8。

圖8 尼式染色觀察海馬神經元凋亡情況Fig.8 Nissl staining to observe the hippocampal neuron apoptosis

3 討論

目前，抑郁癥動物模型大致分為應激模型、手術造模、藥物造模和遺傳造模四類[7]。其中，慢性不可預知溫和應激(CUMS)模型，以持續數周每天人為給予實驗動物不同種不可預知刺激為手段，模擬人類社會環境中不可拒絕的壓力誘導嚙齒類動物的抑郁行為[8]。孤養模型通過將大鼠長期單籠飼養，以模擬被動的社會孤立應激誘導動物的抑郁行為[9]。SHR與人類原發性高血壓相似程度高且模型成熟穩定，是研究高血壓病常用的動物模型。故本實驗采用慢性不可預知溫和應激聯合孤養SHR大鼠，貼合高血壓并發抑郁癥患者生理與心理的病癥特點，且可有效避免單一造模的假陽性結論，探索穩定的動物高血壓并發抑郁癥模型。

Wistar-Kyoto(WKY)大鼠與SHR大鼠均由Wistar品系繁殖而來，同屬變異系大鼠，常用作SHR大鼠的正常血壓對照組[10]。同時，WKY大鼠在各種行為學檢測中表現較差，展現出高水平的內源性抑郁樣行為特點[11]。1963年由Okamoto等發現，并由Paré WP驗證為一種內源性抑郁癥動物模型[12]，這使其不適宜作為行為學檢測的正常對照組。故本實驗中使用SD大鼠作為慢性不可預知溫和應激聯合孤養SHR大鼠這一復合模型的正常對照。

CUMS聯合孤養模型的核心標準是實驗動物出現獎賞行為和快感缺乏，主要包括糖水消耗率減少、顱內自我刺激閾值增加、體質量和食欲下降、前額葉皮層和海馬區萎縮、細胞凋亡等[8]。本實驗結果顯示，造模結束后，模型組大鼠收縮壓顯著性升高，毛發色澤暗淡枯槁，精神萎靡，膽小、喜蜷縮拱背，食欲差，體質量增長率顯著性降低，即一般情況最差。水平活動與直立次數明顯降低，即其對未知環境的探索能力和興趣明顯下降。糖水消耗率顯著性降低，即獎賞行為表現最差。強迫游泳不動時間顯著性延長，即絕望程度最深。提示，SHR大鼠慢性應激后，存在體質量降低、活動性和探索能力降低和獎賞行為缺乏等抑郁行為。

單胺神經遞質水平下調亦是抑郁癥模型的重點評價指標。經典的“單胺假說”認為，中樞神經系統5-羥色胺系統缺陷是抑郁癥潛在的病理生理學基礎[13]。血清5-HT水平可反映顱內5-HT的水平變化[14]，持續低水平的5-HT會影響到大腦調節情緒的功能區，產生抑郁等負面情緒，導致抑郁癥的發生[15]。本實驗結果顯示，模型組5-HT含量顯著性降低。提示，SHR大鼠給予慢性應激后機體存在抑郁狀態。

海馬對HPA軸的負反饋調節、海馬齒狀回的顆粒下層和嗅球具有神經可塑性，使其成為與抑郁癥相關的關鍵大腦區域[16]。慢性應激可引起海馬區細胞凋亡，影響海馬細胞的完整性[17]。研究表明，抑郁癥患者的海馬區細胞凋亡[18]。在本實驗中，與空白組比較，模型組大鼠海馬神經元細胞核染色加深，胞體固縮，部分細胞凋亡，排列疏松，尼氏小體數量減少。提示，SHR大鼠給予慢性應激后，海馬神經元存在一定程度的損傷。

綜上所述，從整體上來說，采用CUMS聯合孤養的方法干預SHR大鼠，可使SHR大鼠行為學、血清中5-HT與海馬區神經元呈現抑郁樣改變。從行為學指標、生化指標、神經病理學等多個層面展示了與臨床高血壓并發抑郁癥的相似性，為后續實驗的開展提供了一定的實踐依據。