環境DNA方法對進口親蝦攜帶水中宿主物種的鑒定

張 娜 ， 劉 驍 ， 鄭 樞 ， 謝艷輝 ， 劉 葒 ， 鄭舒尹 ， 李家僑

(1.湛江海關技術中心 ， 廣東 湛江 524000 ； 2.湛江海關 ， 廣東 湛江 524000；3.深圳海關動植物檢驗檢疫技術中心 ， 廣東 深圳 518045)

環境DNA(Environmental DNA，eDNA)是環境樣本中發現的，許多不同生物體基因組DNA的復雜混合物[1]。環境樣本包括土壤、沉淀物、水和糞便等，也包括過濾空氣或水、過濾沉積物或大塊狀樣品所產生的物質。eDNA的研究對象是環境樣本中提取的DNA，基于環境樣本DNA的收集為所研究的體系獲得盡可能全面的分類或功能信息[2]。傳統的生物多樣性評估方法是利用捕獲或記錄的個體來確定生物的存在或豐度，與直接取樣的傳統生物多樣性評估方法不同，eDNA檢測方法具有非侵入性和敏感性。一些研究證實，eDNA已經成功應用于單一物種生物入侵、難以捕獲或威脅性較大的動物物種監測中[3-4]。eDNA檢測方法在檢測瀕危、低密度入侵的生物監測時比傳統的生物監測方法更準確、更靈敏[5-7]。Biggs等采用eDNA方法對英國瀕危大冠蠑螈的監控效率比傳統方法高出許多，并且不會產生假陽性[8]。eDNA研究具有易野外取樣和能探測隱秘物種等優點，對于廣泛直接取樣的生態系統監測來說是一種有吸引力的替代方法[9-10]。

種蝦入境不僅具有外來物種入侵風險，而且存在傳播疫病風險，容易給養殖戶及企業造成重大經濟損失。養殖水作為水生動物生存的重要環境因素，也可成為一種外來物種入侵和疫病生物風險因素之一。本試驗以進口親蝦攜帶水作為研究對象，運用eDNA檢測方法進行凡納濱對蝦物種檢測分析，并對攜帶水進行宏基因組測序，分析進口親蝦攜帶水中凡納濱對蝦物種含量，為水生動物外來物種入侵技術的探討提供基礎數據，為eDNA技術在檢測外來物種入侵中的應用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 進境親蝦及水樣品，由本實驗室保存；DNeasy Blood and Tissue Kit，購自德國QIAGEN有限公司；ExTaq酶，購自寶生物工程(大連)有限公司；硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜和聚碳酸酯膜，均購自北京優尼康生物科技有限公司；PCR管，購自愛思進生物技術(杭州)有限公司；UltraTMDNA Library Prep Kit，購自美國NEB生物公司；GenNextTMNGS Library Quantification Kit，購自日本東洋紡生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設備 PCR儀(ABI ProFlex，美國ABI)，高速冷凍離心機(Eppendorf 5417R，德國艾本德)，真空泵(GM-0-33A，天津津騰實驗設備有限公司)，Qubit熒光儀(Qubit 4，美國Invitrogen)，超聲波基因組剪切儀 (M220,美國Covaris)。

1.3 試驗方法

1.3.1 水樣品eDNA收集和DNA提取 以進口親蝦攜帶水樣為研究對象，每個水樣取1～2 L，使用孔徑為0.45 μm的過濾膜，采用無菌真空抽濾裝置進行過濾。每次過濾之前用無菌水、0.5 mol/L氫氧化鈉、3%次氯酸鈉沖洗過濾漏斗，防止交叉污染。過濾完成后，將每張過濾膜單獨放入1.5 mL離心管中，-20 ℃保存備用。

按照DNeasy Blood and Tissue Kit試劑盒說明書提取 DNA，為了利于過濾膜中的DNA釋放，對樣品處理稍加改進。將過濾膜取出解凍后，用剪刀將過濾膜剪成細條狀，放入 2 mL 的離心管中，加入試劑盒中裂解液 ATL 550 μL和蛋白酶 K 80 μL，渦旋混勻，恒溫水浴 3 h (期間每隔 15 min 輕輕顛倒混勻)；加入試劑盒中Buffer AL 600 μL，渦旋振蕩混勻。之后的操作步驟按照試劑盒說明書進行。提取的核酸置于-20 ℃備用。

1.3.2 不同過濾膜、不同樣本體積對于eDNA獲取的影響 以20個進口親蝦攜帶水樣為研究對象，分別取硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜和聚碳酸酯膜3種過濾膜進行過濾，每種過濾膜的孔徑均為0.45 μm。每個樣本、每個過濾膜分別過濾水樣1 L、2 L，對應每個過濾膜分別做2個重復。過濾后的過濾膜按照1.3.1方法進行DNA提取，通過Quibt熒光計測定DNA濃度。

1.3.3 凡納濱對蝦宿主物種鑒定 在 GenBank 數據庫中檢索凡納濱對蝦 EF584003.1線粒體保守基因序列，使用 Primer Premier 6軟件設計引物。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，預計擴增片段為347 bp。引物序列為：F2:5′-AACAGCCCTCACTA-TTTCAAG-3′；R2:5′-ATCGTTGCGTTGGATAAAATG-3′。

提取凡納濱對蝦組織 DNA進行PCR擴增。擴增體系：10×PCR buffer(Mg2+Plus) 2.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，dNTP(10 mmol/L)2 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，DNA 5 μL，加水至25 μL。擴增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min,35個循環；72 ℃ 10 min。將10 μL PCR擴增產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶送生工生物工程(上海)股份有限公司進行目的條帶測序和質粒構建。目的條帶序列在NCBI網站進行比對分析，確定為凡納濱對蝦 EF584003.1線粒體基因序列，質粒放置于-20 ℃保存備用。

1.3.4 不同來源水樣中的宿主物種鑒定比對 設立3個不同來源的水樣進行比對試驗，分別為：成蝦養殖池塘水樣(10份樣品)、進口親蝦攜帶水水樣(10份樣品)、親蝦養殖池塘水樣(10份樣品)。每份水樣分別取1.5 L并用硝酸纖維膜過濾，提取過濾膜DNA，按照1.3.3方法進行宿主物種鑒定。

1.3.5 不同過濾膜中的宿主物種鑒定比對 根據1.3.2結果分析，聚碳酸酯膜過濾易發生堵塞，過濾水樣體積達不到1.5 L，所以本階段過濾分別使用硝酸纖維素膜和玻璃纖維膜對20份進口親蝦攜帶水樣進行過濾，每個樣品過濾1.5 L，按照1.3.3方法進行宿主物種鑒定。

1.3.6 不同取樣時間的宿主物種鑒定比對 取4份進口親蝦水樣(設為水樣1、水樣2、水樣3、水樣4)，每份水樣設置2個重復，每份水樣分別是放置0 h、0.5 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d和6 d后過濾。按1.3.1方法提取過濾膜DNA，通過1%瓊脂糖凝膠方法觀察DNA降解情況。按1.3.3方法進行宿主物種鑒定。

1.3.7 水過濾膜eDNA的宏基因組測序分析 對進口親蝦攜帶水過濾膜提取的DNA使用Quibt熒光計進行濃度測定，送往廣州美格生物科技有限公司進行宏基因組測序。取質量合格的樣品構建基因文庫。利用超聲波基因組剪切儀將各基因組 DNA 樣本隨機打斷成300 bp左右的片段，隨后進行文庫構建。進行數據分析，首先對原始序列進行去接頭、質量剪切以及去除污染等優化處理，然后使用優質序列進行拼接組裝和基因預測，對得到的基因進行物種和功能上的注釋以及分類。

2 結果

2.1 不同過濾膜、不同樣本體積對于eDNA獲取的影響 分別用硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜、聚碳酸酯膜3種過濾膜過濾水樣1 L、2 L。結果如圖1和圖2所示，使用硝酸纖維素膜過濾水樣獲得的eDNA的濃度大于相同體積的玻璃纖維膜、聚碳酸酯膜。在過濾過程中玻璃纖維膜過濾速度最快，而聚碳酸酯膜過濾最慢，并且容易發生堵塞。在過濾2 L水樣時，聚碳酸酯膜發生堵塞的情況最多，影響后續試驗結果。從結果還可以看出，過濾2 L水樣比過濾1 L水樣時獲得的eDNA的濃度高，但是低于1 L水樣得到的eDNA濃度的2倍，說明水樣中eDNA的獲取達不到與體積成正比關系，會受到過濾膜中DNA提取、水樣過濾時損失等因素的影響。

圖1 3種過濾膜分別過濾1 L親蝦攜帶水的eDNA濃度對比 Fig.1 Comparison of eDNA concentration in 1 L parent shrimp carrying water filtered by three kinds of filtration membranes

圖2 用3種過濾膜分別過濾2 L親蝦攜帶水的eDNA濃度對比 Fig.2 Comparison of eDNA concentration in 2 L parent shrimp carrying water filtered by three kinds of filtration membranes

2.2 不同來源水樣中的宿主物種鑒定比對 如圖3所示，本試驗成功地從10份成蝦養殖池塘水樣中擴增出347 bp的特異性目的片段，目的條帶單一且明亮，與預期大小一致；如圖4所示，10份親蝦養殖池塘水樣(飼養超過15 d)中有8份水樣成功擴增出特異性目的片段；如圖5所示，10份進口親蝦攜帶水水樣中有4份水樣成功擴增出特異性目的片段。測序結果在 NCBI 網站上進行比對分析，結果顯示，擴增條帶的序列與EF584003.1線粒體基因片段同源性達100%。

圖3 成蝦養殖池塘水樣凡納濱對蝦物種鑒定Fig.3 Species identification of Penaeus vannamei in water samples from adult shrimp culture ponds1～10:10個成蝦養殖池塘水樣鑒定的PCR擴增產物； M：DL-2 000 DNA Marker1-10:PCR amplification products of 10 water samples from adult shrimp culture ponds; M:DL-2 000 DNA Marker

圖4 親蝦養殖池塘水樣凡納濱對蝦物種鑒定Fig.4 Species identification of Penaeus vannamei in water samples from broodstock culture ponds1～10:10個親蝦養殖池塘水樣鑒定的PCR擴增產物； M：DL-2 000 DNA Marker 1-10:PCR amplification products of 10 water samples of broodstock culture ponds; M:DL-2 000 DNA Marker

圖5 進口親蝦水樣凡納濱對蝦物種鑒定 Fig.5 Species identification of Penaeus vannamei in water samples from imported parent shrimps1～10:10個進口親蝦水樣鑒定的PCR擴增產物； P：陽性對照； M：DL-2 000 DNA Marker1-10:PCR amplification products of 10 water samples from imported parent shrimps; P: Positive control; M:DL-2 000 DNA Marker

2.3 不同過濾膜中的宿主物種鑒定比對 如圖6所示，硝酸纖維素膜過濾后，20份水樣中有12份水樣成功擴增出特異性目的片段；如圖7所示，玻璃纖維膜過濾后，20份水樣中有9份樣品成功擴增出特異性目的片段。此結果與2.1結果一致，同樣體積的水樣使用硝酸纖維素膜過濾后獲得的eDNA濃度較高，擴增效果好。

圖6 硝酸纖維素膜過濾進口親蝦水樣的凡納濱對蝦物種鑒定Fig.6 Species identification of Penaeus vannamei in water samples from imported parent shrimps filtered by nitrocellulose membrane1～20:20個經硝酸纖維素膜過濾的進口親蝦水樣的PCR擴增產物； P：陽性對照；N：陰性對照； M：DL-2 000 DNA Marker1-20:PCR amplification products of 20 water samples from imported parent shrimps filtered by nitrocellulose membrane; P:Positive control; N:Negative control; M:DL-2 000 DNA Marker

圖7 玻璃纖維膜過濾進口親蝦水樣的凡納濱對蝦物種鑒定Fig.7 Species identification of Penaeus vannamei in water samples from imported parent shrimps filtered by glass fiber membrane1～20:20個經玻璃纖維膜過濾的進口親蝦水樣的PCR擴增產物； N：陰性對照； P：陽性對照； M：DL-2 000 DNA Marker1-20:PCR amplification products of 20 water samples from imported parent shrimps filtered by glass fiber membrane; N:Negative control; P:Positive control; M:DL-2 000 DNA Marker

2.4 不同取樣時間的宿主物種鑒定比對 如圖8所示，樣品放置時間越長，DNA降解越多，在放置0.5 d后過濾已經有DNA降解，在放置3 d過濾獲得的DNA降解非常多，在放置6 d時DNA已經全部降解。

凡納濱對蝦特異性鑒定結果如圖9～圖11所示,樣品不放置(0 h)時，所有樣品PCR擴增條帶均非常亮；在水樣放置2 d后，PCR擴增條帶已非常弱。但由圖8結果對比可知，放置2 d后的樣品過濾得到的DNA降解不嚴重。過濾后可以鑒定出宿主的水樣最長放置時間分別為：水樣1為3 d，水樣2為4 d，水樣3為4 d，水樣4為3 d。

圖8 進口親蝦水樣放置不同時間進行過濾后DNA電泳降解圖 Fig.8 DNA electrophoretic degradation of water samples from imported parent shrimps after filtration at different time1～8：樣品放置0 h、0.5 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d; P：陽性對照； N：陰性對照； M：DL-5 000 DNA Marker 1-8:Samples were placed for 0 h,0.5 d,1 d,2 d,3 d,4 d,5 d,6 d; P:Positive control; N:Negative control; M：DL-5 000 DNA Marker

圖9 進口親蝦水樣1和水樣2分別在放置不同時間過濾后凡納濱對蝦物種鑒定 Fig.9 Species identification of Penaeus vannamei in water sample 1 and sample 2 from imported parent shrimps after filtration at different time1～8和A～H：樣品1和樣品2分別放置0 h、0.5 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d；N：陰性對照； P：陽性對照； M: DL-2 000 DNA Marker1-8 and A-H：sample 1 and sample 2 were placed for 0 h,0.5 d,1 d,2 d,3 d,4 d,5 d,6 d; N:Negative control; P:Positive control； M：DL-2 000 DNA Marker

圖10 進口親蝦水樣3在放置不同時間過濾后凡納濱對蝦物種鑒定Fig.10 Species identification of Penaeus vannamei in water sample 3 from imported parent shrimps after filtration at different time1～8：樣品3放置0 h、0.5 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d; N：陰性對照； P：陽性對照； M：DL-2 000 DNA Marker1-8:Sample 3 was placed for 0 h,0.5 d,1 d,2 d,3 d,4 d,5 d,6 d; N:Negative control; P:Positive control； M：DL-2 000 DNA Marker

圖11 進口親蝦水樣4在放置不同時間過濾后凡納濱對蝦物種鑒定Fig.11 Species identification of Penaeus vannamei in water sample 4 from imported parent shrimps after filtration at different time1～8：樣品4放置0 h、0.5 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d; N：陰性對照； P：陽性對照； M：DL-2 000 DNA Marker1-8:Sample 4 was placed for 0 h,0.5 d,1 d,2 d,3 d,4 d,5 d,6 d; N:Negative control; P:Positive control； M：DL-2 000 DNA Marker

2.5 水過濾膜eDNA的宏基因組測序分析 對進口親蝦的環境水過濾膜進行宏基因組測序，使用 DIAMOND 軟件將 UniqGeneSet 與 NCBI 的NR 序列進行比對(Blastp 比對參數設置期望值為1e-5)；取相似度最高的比對序列作為該序列的物種注釋信息，基因豐度總和計算該物種的豐度，并在各個分類學水平上統計物種在各個樣品中的豐度，從而構建相應分類學水平上的豐度譜(Abundance profile)。為了綜合而直觀的展示各樣品中不同分類層級的物種相對豐度，采用 Krona 對物種注釋結果進行可視化展示，十足目(Decapoda)對蝦科(Penaeidae)對蝦屬(Penaeus)的總序列豐度占比如圖12所示，凡納濱對蝦(Penaeusvannamei)物種序列占對蝦屬的40%，日本對蝦(Penaeusjaponicus)占38%，斑節對蝦(Penaeusmonodon)占10%，加州對蝦(Penaeuscaliforniensis)占3%，印度對蝦(Penaeusindicus)占3%，中國對蝦(Penaeuschinensis)占2%，其他對蝦屬(Penaeussp.)序列占3%。在宏基因組測序得到的所有物種序列中，宿主凡納濱對蝦測序序列物種豐度占比最高。

圖12 水濾膜eDNA的宏基因組測序 Krona 示例圖Fig.12 Krona map after metagenome sequencing of water filtration membrane eDNA

3 討論

3.1 不同過濾膜、不同樣品體積對于eDNA獲取的影響 有文獻報道已經說明，eDNA濃度和過濾樣本體積呈正增長關系[11]，但是，樣本量過大時容易發生過濾膜堵塞情況。本試驗中，對20份樣本分別用硝酸纖維素膜、玻璃纖維膜、聚碳酸酯膜進行過濾，結果顯示，玻璃纖維膜不容易堵，流速也快，過濾所用時間最短，過濾的樣品量也最多，最多的時候可以達到4 L；聚碳酸酯膜過濾效果不好，且容易發生堵塞。所以水樣渾濁或有大量浮游植物時，先用大孔徑(如100目)尼龍膜預過濾后再用0.45 μm孔徑過濾膜過濾效果更好。

3.2 凡納濱對蝦的特異性引物設計 大多數eDNA可能來源于排放的尿液和糞便物質[12-13]、從外部黏液層脫落的上皮細胞[14]和從分解有機體中脫落的組織[15]。研究顯示，魚類、兩棲動物和軟體動物向環境中釋放大量的eDNA[16]。Tréguier等[17]在低豐度條件下檢測小龍蝦eDNA時遇到了困難，節肢動物的eDNA似乎很難檢測，可能是因為它們的外骨骼減少了表皮細胞的脫落。本試驗設計驗證了多個凡納濱對蝦物種鑒定引物，在驗證不同引物時，有的引物的PCR擴增產物在測序時會得到很多非特異性結果，分析原因應是eDNA 的成分較為復雜，含有許多其他物種和細菌、病毒的DNA，所以對引物的特異性要求更高。本試驗設計并驗證后選用的凡納濱對蝦物種鑒定引物的特異性較強，沒有擴增出其他物種序列，且該引物靈敏度較好。

3.3 不同條件對凡納濱對蝦物種鑒定的影響 蝦體養殖時間較長的蝦塘水樣，更容易進行宿主物種鑒定。已有多個研究證實，eDNA的含量與對蝦的生存時間和排泄能力有關[18-21]。本試驗中部分進口親蝦攜帶水水樣沒有擴增出凡納濱對蝦的特異性條帶，分析原因是攜帶水中蝦的數量較少或蝦在攜帶水中的生存時間較短，所釋放的eDNA含量太低。這個情況也是eDNA方法用于鑒定水中物種的缺點之一，需進一步加強eDNA濃縮和富集方法的研究。

eDNA衰變的主要途徑是組織和顆粒的物理降解。脫落的生物組織快速從多細胞組織碎片降解為單個細胞、分離的細胞器(如線粒體)，并最終釋放DNA，然后通過外源酶或自發的化學反應進一步降解DNA，降解的程度影響eDNA是否可以被捕獲[22-24]。本試驗在對比放置時間對于物種鑒定的影響時，結果顯示，樣本放置時間越長，eDNA的降解越多，物種鑒定越困難，故建議采集樣本后馬上進行過濾和收集處理。本試驗在進行過濾時發現，如果樣本馬上過濾則不易出現過濾膜堵塞情況，如果樣品放置12 h后再進行過濾，則過濾膜很容易堵塞，水樣中會出現一些黏液狀物質，分析應該是細胞破裂后的黏液。同時，本試驗還發現，樣品馬上過濾時鑒定引物擴增得到的PCR條帶最亮，而在水樣放置2 d后過濾，鑒定擴增條帶非常弱，但是樣品馬上過濾和放置2 d后過濾所得到的核酸濃度相差不大，所以不能只以核酸濃度來判斷樣本所獲得的eDNA是否有效。

3.4 宏基因組測序在eDNA方法中的應用 宏基因組學是以生態環境中全部DNA作為研究對象，通過克隆、異源表達來篩選有用基因及其產物，研究其功能和彼此之間的關系和相互作用，并揭示其規律的一門科學，它決定了生物群體的生命現象[5,25]。目前，宏基因組測序是eDNA研究的一個重要方法[26]。本試驗對親蝦攜帶水進行宏基因組測序并進行數據分析，采用Virus Refseq、Virus NT和Acalme 三個數據庫進行比對，最終的注釋結果是選取的最優注釋。本試驗在進行NCBI網站比對時，測序序列是與NCBI中全庫序列進行比對，由于測序片段較短，序列比對很可能比對到其他物種上，且在線比對的參數與流程中的參數不一致，NCBI上的數據庫實時更新，本試驗數據無法實時更新，數據庫的差異也會導致比對結果的差異。DNA宏基因組編碼還面臨著幾個重要的技術難題，主要涉及引物偏差和PCR錯誤，更普遍的是需要在所有水平上進行試驗標準化，以便進行交叉試驗比較。因此，eDNA研究不僅在試驗方法上，而且在記錄相關單元分析數據方面都非常需要標準化[27]。

3.5 eDNA檢測方法的應用與發展 eDNA檢測方法的高靈敏性和可遠程檢測是其具有吸引力的主要原因，國外使用該方法在生物入侵方面的研究已經很多。該方法非常適合于檢測瀕危、低密度入侵、瞬時和隱秘物種，特別是當低密度物種的采樣難以控制時,eDNA檢測方法的敏感性、簡單性和減少破壞的優勢愈加顯現出來。eDNA檢測方法仍存在許多不足，比如：如何抵抗水的流動性對于eDNA收集的影響；eDNA收集的標準化和一致性；宏基因組測序的有效性等等，這些方面仍需要更深入地研究。