云南省獨龍牛賈第蟲分子流行病學調查

莊爾俊 ， 岳鳳嬌 ， 趙俊杰 ， 李海龍,2

(1.大理大學基礎醫學院 ， 云南 大理 671000 ； 2.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室 ， 云南 大理 671000)

藍氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia,G.lamblia)簡稱賈第蟲，是一種人獸共患、腸道內寄生的單細胞原蟲，呈世界性分布[1]。賈第蟲感染宿主種類多，除人外，還包括絕大多數的哺乳動物[2]。賈第蟲病的傳播途徑主要是糞—口傳播，由糞便污染的水源、食物或直接接觸糞便引起，感染后可出現持續性腹瀉、吸收不良、稀便、脹氣、疲勞等癥狀[3]。近年來，國內外對于人和動物感染賈第蟲的流行病學調查和基因型鑒定日益增多，在我國廣東、上海、河南、江西、寧夏等地均已有報道[4-8]。

哺乳動物中牛是賈第蟲常見的宿主之一，獨龍牛(Bosfrontalis,B.frontalis)是云南省怒江州的珍稀牛種，主要分布于云南省怒江州。賈第蟲作為一種人獸共患寄生蟲，其感染不僅可能對獨龍牛的健康帶來影響，引起疾病，還可能威脅當地居民的健康和公共衛生。本試驗以怒江州獨龍牛為調查對象，進行賈第蟲的分子流行病學調查，旨在為當地賈第蟲的防控和研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 于2017年9月—2018年9月，在云南省怒江州5個采樣點，分別為怒江流域的古泉村、亞左洛村、鳩門當村、茨開鎮和獨龍江流域的獨龍江鄉，按4個季節(春、夏、秋、冬)采集新鮮獨龍牛糞便共987份，其中怒江流域813份，獨龍江流域174份，-20 ℃保存。賈第蟲陽性DNA樣本由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 糞便DNA提取試劑盒，購自美國OMEGA公司；MgCl2、dNTPs Mixture、10×PCR Buffer、TaqDNA聚合酶、DNA Marker DL2 000、6×DNA Loading Buffer，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA的提取與引物設計 根據糞便DNA提取試劑盒說明書步驟提取獨龍牛糞便樣本DNA，置-20 ℃凍存備用。目的基因根據賈第蟲β-賈第素(β-giardin,BG)基因，參考Bartley等[9]發表的研究報道設計2對引物，第1對引物：上游引物F1：5′-AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGTGC-3′，下游引物R1：5′-GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC-3′；第2對引物：上游引物F2：5′-GAACGAACGAGATCGAGGTCCG-3′，下游引物R2：5′-CTCGACGAGCTTCGTGTT-3′。

1.3.2 巢式PCR擴增 采用巢式PCR，預擴增產物為511 bp。PCR擴增體系(總體積25 μL)：10×PCR Buffer 2.50 μL，MgCl21.50 μL，dNTP Mixrure 2.00 μL，Ex-Taq0.25 μL，引物F1/R1、F2/R2均為0.25 μL，模板DNA 2.50 μL，加ddH2O補至25.00 μL。第1輪擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共34個循環；72 ℃再延伸10 min；第2輪擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共34個循環；72 ℃再延伸10 min。取5 μL PCR產物與1 μL的6×DNA Loading Buffer混合后，進行2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，電泳時間約30 min。

1.3.3 測序結果分析 將PCR擴增結果中與目的條帶大小相近的產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。用Clustal X 1.83和BLAST對測序結果進行序列比對，所獲得的樣本序列在GenBank 上與賈第蟲參考序列進行同源性比對，然后用MEGA-X計算序列之間的遺傳距離，采用鄰接法(Neighbor-joining,NJ)構建系統進化樹。

1.3.4 統計學分析 使用SPSS 19.0軟件對試驗數據進行統計分析，采用卡方檢驗分析不同采樣點、不同流域和不同季節中獨龍牛的賈第蟲感染率的差異。當P<0.05時，統計學差異顯著。

2 結果

2.1 巢式PCR擴增 根據賈第蟲BG基因位點進行巢式PCR擴增，987份獨龍牛糞便樣品中，共有102份擴增出大小約為511 bp的條帶(圖1)，總陽性率為10.33%。

圖1 賈第蟲BG基因的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of BG gene from G.lambliaM:DL2 000 DNA Marker； 1：陽性對照； 2：陰性對照； 3～17:部分陽性樣品M:DL2 000 DNA Marker; 1:Positive control; 2:Negative control; 3-17:Some positive samples

2.2 測序結果分析及基因型鑒定 對獲得的賈第蟲102份陽性樣品的測序結果進行比對分析，共檢測出集聚體 A、B和E三種基因型，包括A集聚體亞型集聚體AII，均為人獸共患基因型；人獸共患基因型集聚體A的數量最多，共有93份(91.18%,93/102)。5個采樣點中均有集聚體A感染，集聚體B和E僅在鳩門當村有感染(表1)。基于BG基因進行系統發育分析并構建進化樹，序列分析結果顯示，共有8條不同的DNA序列，上傳至GenBank，登錄號分別為MZ682631、MZ701835、MZ720824～MZ720829)(圖2)。賈第蟲集聚體A基因型與GenBank：EU769205.2相比，序列同源性為96.93%～99.70%；賈第蟲集聚體E基因型與GenBank：KY658184.1相比，序列同源性為100%；賈第蟲集聚體B基因型與GenBank：MT713324.1相比，序列同源性為99.16%。

表1 云南省獨龍牛賈第蟲基因型分布Table 1 Genotypes of G.lamblia in B.frontalis in Yunnan Province

圖2 賈第蟲BG基因系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of G.lamblia based on BG gene sequence▲:本試驗鑒定的集聚體A基因型； ■：本試驗鑒定的集聚體B基因型； ●：本試驗鑒定的集聚體E基因型▲：Assemblage A genotypes identified in this study； ■：Assemblage B genotype identified in this study； ●：Assemblage E genotype identified in this study

2.3 獨龍牛賈第蟲感染情況統計 987份獨龍牛糞便樣品中賈第蟲陽性樣本共102份，總感染率為10.33%，5個地點中，怒江流域的古泉村、亞左洛村、鳩門當村、茨開鎮感染率分別為10.19%(21/206)、13.90%(26/187)、11.98%(23/192)、8.33%(19/228)，獨龍江流域的獨龍江鄉感染率為7.47%(13/174)，亞左洛村與獨龍江鄉之間賈第蟲感染率差異顯著(P<0.05)；獨龍江流域和怒江流域感染率分別為7.47%(13/174)和10.95%(89/813)，差異不顯著(P>0.05)(表2)。春、夏、秋、冬4個季節中，賈第蟲感染率分別為12.05%(30/249)、10.55%(25/237)、8.68%(23/265)、10.17%(24/236)，經統計學分析比較，差異不顯著(P>0.05)(表3)。

表2 不同采樣點賈第蟲的感染情況Table 2 Infection of G. lamblia in different sampling sites

表3 不同季節賈第蟲的感染情況Table 3 Infection of G.lamblia in different seasons

3 討論

近年來，國外的研究報道顯示，獨龍牛可感染牛弓首蛔蟲、指形長刺線蟲、棘球絳蟲、弓形蟲[10-12]，國內的獨龍牛感染的寄生蟲有環孢子蟲和畢氏腸微孢子蟲[13-14]。人和動物賈第蟲的流行病學調查在世界范圍內均有報道，但我國云南省獨龍牛賈第蟲的相關報道較為罕見。本試驗通過調查云南省怒江州獨龍牛賈第蟲的感染情況，發現獨龍江和怒江兩大流域感染率差異不顯著(P>0.05)，亞左洛村感染率最高，獨龍江鄉感染率最低，可能與當地養殖模式有關。本試驗中獨龍牛感染陽性率為10.33%，與江西省報道的牛感染率相近(9.2%)[7]；高于甘肅省奶牛感染率(1%)[15]，西藏自治區牛感染率(3.8%)[16]；低于江蘇省奶牛感染率(20.6%)[17]，四川省斷奶后犢牛感染率(41.2%)[18]，廣東省斷奶前奶牛感染率(74.2%)[19]。賈第蟲感染率的差異可能與地理位置、生態環境、采樣數量、品種、檢測方法、植被以及自身免疫狀況等因素相關。本試驗結果顯示，四季中獨龍牛賈第蟲感染率在春季最高，秋季最低，但差異不顯著(P>0.05)，四季感染率呈現不同流行趨勢，可能是由于獨龍牛所處怒江地區為低緯帶高海拔，造就了獨特的立體氣候導致的。

本試驗基于賈第蟲BG基因，通過測序分析，鑒定出3種基因型，分別為集聚體A、B、E，其中集聚體A有93份(93/102)，5個采樣點中均有感染，推測為怒江州獨龍牛感染賈第蟲的優勢基因型，集聚體B(1/102)和集聚體E(8/102)僅在鳩門當村有感染。目前為止，賈第蟲具有8種基因型，即集聚體A～H，根據Li等[20]的研究報道，集聚體A、B、E均為人獸共患基因型，集聚體E為我國牛感染賈第蟲的優勢基因型。

獨龍牛是怒江州當地獨龍族居民長期馴養的一種半野生畜種，繁育價值高，具有良好的經濟前景，但因地處偏遠山區，增加了人獸共患寄生蟲病的防治工作難度。本試驗結果表明，獨龍牛感染的賈第蟲基因型均為人獸共患基因型，對當地獨龍牛產業以及公共衛生構成威脅，建議有關部門定期檢查和驅蟲，加強對賈第蟲的防治以及宣傳教育，做好水源衛生管理。