牦牛源產氣莢膜梭菌青海分離株的生物學特性

李宇鵬 , 吳 丹 , 羅潤波 , 宋仁德 , 格桑卓瑪 , 白 吉 , 索朗斯珠

(1. 西藏農牧學院動物科學學院 ， 西藏 林芝 860000 ； 2. 青海玉樹藏族自治州畜牧獸醫工作站 ， 青海 玉樹 815099 ； 3. 西藏自治區動物疫病預防控制中心 ， 西藏 拉薩 850014)

產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)又稱魏氏梭菌，兼性厭氧，為可產生芽孢的革蘭陽性大桿菌，廣泛分布于自然界中，是一種重要的人獸共患的條件致病菌[1]；根據其產生的致死性毒素α、β、ε、ι毒素可將其分為A、B、C、D和E共5個毒素型[2]。其中C型產氣莢膜梭菌主要產生α和β毒素，可以引發人和禽類的壞死性腸炎、初生小牛和羔羊等反芻動物的腸毒血癥、羊猝疽和仔豬紅痢等多種嚴重疾病，對養殖業的發展產生較大的危害。據報道，產氣莢膜梭菌可引起牦牛猝死綜合征，主要的臨床特征有牛舌脫垂、肛門外翻，病理剖檢可見肺敗血癥、腸淤血和腸出血等癥狀[3]。本試驗通過對牦牛源產氣莢膜梭菌生物特性進行研究，為牦牛源產氣莢膜梭菌后續研究和防治等方面提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌株 由西藏農牧學院預防獸醫實驗室從青海玉樹地區牦牛糞樣中分離保存的1株牦牛源產氣莢膜梭菌，命名為qinghai-12。

1.2 主要試劑和儀器 梭菌增菌液體培養基、7%羊血瓊脂培養基基礎，均購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；無菌脫纖維綿羊血，購自北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)試紙，購自意大利Liofilchem公司；Trans 2K DNA Marker、核酸染料GelStain(10 000×)，均購自北京全式金生物技術有限公司。

PCR儀由Applied Biosystems公司生產；電泳儀、凝膠成像系統，均由美國Bio-Rad生產；高速離心機由德國Eppendorf生產；恒溫恒濕培養箱由上海博訊實業有限公司生產；UV-1800PC型紫外可見分光光度計由上海美譜達儀器有限公司生產。

1.3 菌株復蘇培養與觀察 將凍存于-80 ℃的牦牛源產氣莢膜梭菌緩慢梯度升溫解凍，三區劃線法接種于無菌血瓊脂平板，41 ℃恒溫厭氧培養18～24 h。隨后將單菌落接種至梭菌增菌液體培養基中，41 ℃恒溫厭氧增菌培養16～18 h。革蘭染色后用光學顯微鏡觀察。

1.4 生化鑒定 根據《伯杰細菌鑒定手冊》[4]，利用8種(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、吲哚、乳糖、脂酶、卵磷脂酶、酪蛋白)細菌微量生化管鑒定產氣莢膜梭菌的基本生化特性。根據陸承平[5]推薦方法，取對數生長期的梭菌增菌液體培養基1 mL接種于適量無菌石蕊牛奶液體培養基，在45～47 ℃水浴2 h后，每隔1 h觀察有無“洶涌發酵”現象，此特性為鑒定產氣莢膜梭菌最為突出的生化特性。

1.5 PCR鑒定

1.5.1 16S rRNA PCR擴增 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取牦牛源產氣莢膜梭菌全基因組DNA，-20 ℃冷凍保存備用。根據參考文獻[6]合成細菌通用16S rRNA引物，F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。16S rRNA PCR反應體系(50 μL)：上、下游引物各1 μL，2×TaqMix酶 25 μL，模板2 μL，去離子水 21 μL；PCR反應程序：94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃ 終延伸10 min，擴增條帶大小為1 456 bp。PCR產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，委托擎科生物科技有限公司進行測序并上傳至NCBI進行序列比對。

1.5.2 多重PCR分型 根據參考文獻[7]合成產氣莢膜梭菌分型引物(表1)。多重分型PCR體系(50 μL)：上、下游引物(共4對)各1 μL，2×TaqMix酶 25 μL，模板2 μL，去離子水15 μL；PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；72 ℃終延伸5 min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 PCR引物信息Table 1 PCR primer information

1.6 生長曲線測定 參照祖若夫等[8]介紹的振蕩比濁法(Dλ法)，將1.3中制備好的增菌液按體積分數1%接種于300 mL梭菌增菌液體培養基，振蕩混勻后均分至15支試管作為試驗組，同時分裝15支無菌梭菌增菌液試管作為空白對照組，石蠟液封，置于41 ℃恒溫培養箱中持續培養。每隔2 h取出1支試驗組試管和1支空白對照組試管，以空白對照組進行調零，利用UV-1800PC型紫外可見分光光度計測定培養液OD600 nm值，每個時間點重復測量3次，取平均值，連續測量24 h。以OD600 nm值為縱坐標、培養時間為橫坐標，利用Microsoft Excel 2019軟件繪制出牦牛源產氣莢膜梭菌的生長曲線。

1.7 外毒素含量測定 根據單雪梅等[9]介紹方法，在1.6中測定OD600 nm值時，同時吸取適量菌液，12 000 r/min離心10 min，用0.22 μm細菌濾器過濾，制得外毒素粗提取液。分別測定OD280 nm和OD260 nm值，根據蛋白濃度經驗公式計算不同培養時間點培養液的外毒素蛋白質含量(ρ)。

ρ(mg/mL)=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm

1.8 同源性分析 將測得的牦牛源產氣莢膜梭菌16S rRNA序列與NCBI中GenBank數據庫進行比對，在對比結果中選取來自亞洲地區且相似度較高的動物菌株序列，下載其序列后利用MEGA 6.0 軟件構建系統發育樹。

1.9 MIC測定 挑取單菌落接種于梭菌增菌液體培養基中，待菌液濃度生長至0.5個麥氏濁度(OD600 nm：0.8～1.3)，用稀釋涂布平板法均勻涂布于MH培養基上，采用E-test法[10]測定牦牛源產氣莢膜梭菌對8種常用抗菌藥物(頭孢噻肟、青霉素、復方新諾明、氨芐西林、四環素、多黏菌素B、紅霉素、慶大霉素)的MIC。MIC紙條環尖所對應紙條上的數值就是對應抗菌藥對細菌的最低抑菌濃度，根據美國臨床和實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的《抗菌藥物敏感性試驗標準》對測定結果進行判定[11]。

2 結果

2.1 牦牛源產氣莢膜梭菌生長情況觀察 復蘇菌株在血瓊脂平板上生長為表面光滑、半透明、圓屋頂樣菌落并產生雙溶血環(圖1)；在梭菌增菌培養基中生長后培養基液體由透亮的黃色變渾濁；革蘭染色鏡檢顯示，牦牛源產氣莢膜梭菌為革蘭陽性大桿菌，菌體呈直桿狀，兩端鈍圓，常單在或成雙排列(圖2)。

圖1 牦牛源產氣莢膜梭菌在血平皿上的生長情況Fig.1 Growth of Clostridium perfringens from yak on blood plate

圖2 牦牛源產氣莢膜梭菌革蘭染色鏡檢 (1 000×)Fig.2 Gram staining microscopic examination of Clostridium perfringens from yak (1 000×)

2.2 生化鑒定 牦牛源產氣莢膜梭菌生化鑒定結果見表2。該菌株在葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、卵磷脂酶、乳糖、酪蛋白生化管中呈陽性反應；在脂酶和吲哚生化管中呈陰性反應。該菌株在石蕊牛奶中牛乳凝結物破碎后快速形成海綿樣物質，上升到培養基表面，且能發酵乳糖，凝固酪蛋白并大量產氣，呈“洶涌發酵”現象。牛乳發酵試驗結果符合產氣莢膜梭菌基本生化特征。

表2 牦牛源產氣莢膜梭菌生化鑒定Table 2 Biochemical identification of Clostridium perfringens from yak

2.3 PCR鑒定 PCR產物凝膠電泳結果見圖3，16S rRNA PCR產物在約1 456 bp處出現條帶，測序比對結果確定其為產氣莢膜梭菌；毒力分型PCR產物在196 bp和325 bp處出現條帶，檢測到β和α毒素，與C型產氣莢膜梭菌毒素相符合，可確定菌株qinghai-12為牦牛源C型產氣莢膜梭菌。

圖3 16S rRNA(A)和毒力分型(B)的PCR擴增Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA (A) and virulence typing (B)M：Trans 2K DNA Marker； -：陰性對照； 1：菌株qinghai-12M:Trans 2K DNA Marker; -：Negative control; 1:Strain qinghai-12

2.4 生長曲線測定 牦牛源C型產氣莢膜梭菌生長曲線見圖4。該菌株在接種后0～4 h內處于遲緩期；4～8 h處于對數生長期；8～24 h為生長平衡的穩定期；在測定期間內未測量到衰亡期。

圖4 牦牛源C型產氣莢膜梭菌生長曲線Fig.4 Growth curve of Clostridium perfringens type C from yak

2.5 外毒素含量測定 牦牛源C型產氣莢膜梭菌不同時間點外毒素蛋白含量見表3，在培養10 h后，該菌株所產毒素的蛋白質含量達4.173 mg/mL，且隨著時間的推移蛋白質含量持續增長。結果表明，牦牛源C型產氣莢膜梭菌所產外毒素蛋白質在10 h時達到最佳產毒時間，含量達4.173 mg/mL。

表3 牦牛源C型產氣莢膜梭菌毒素蛋白含量Table 3 Toxin protein content of Clostridium perfringens type C from yak

2.6 同源性分析 GenBank中公布的其他產氣莢膜梭菌參考株序列與該菌株序列構建的系統進化發育樹見圖5，該菌株與北京人源(GenBank登錄號：KP944154.1)、安多牦牛源(GenBank登錄號：MN960262.1)、美國豬源(GenBank登錄號：JQ607422.1)、華東兔源(GenBank登錄號：KX986316.1)產氣莢膜梭菌具有較近的親緣性；與中國野豬源(GenBank登錄號：KX094441.1)產氣莢膜梭菌具有較遠的親緣性。

圖5 牦牛源C型產氣莢膜梭菌 16S rRNA遺傳進化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis based on 16S rRNA of Clostridium perfringens type C from yak▲:本試驗分離菌株▲：Strain isolated in this study

2.7 MIC測定 MIC測定結果見表4，牦牛源C型產氣莢膜梭菌對頭孢噻肟、氨芐西林、四環素、青霉素表現為敏感，對紅霉素表現為中度敏感，對慶大霉素、復方新諾明、多黏菌素B表現不敏感。

表4 牦牛源C型產氣莢膜梭菌 MIC測量結果Table 4 MIC measurement results of Clostridium perfringens type C from yak

3 討論

生化試驗是利用生物化學的方法測定微生物的代謝產物、代謝方式和條件進而鑒別細菌的試驗[5]。本試驗中所用牦牛源產氣莢膜梭菌qinghai-12的生化鑒定結果與張瑾瑜[12]鑒定結果相同，均符合產氣莢膜梭菌生化特征。

生長曲線是指以微生物生長量為縱坐標，培養時間為橫坐標所繪制的曲線；常用的微生物生長量的測定方法有對微生物數量、重量及群體生理指標的測定[13]。本試驗選用數量測定中的比濁法，該方法可連續測定以獲得即時數據。本試驗結果顯示，牦牛源C型產氣莢膜梭菌qinghai-12在接種后的0～4 h內處于遲緩期，4～8 h處于對數生長期，8～24 h為生長平衡的穩定期，在測定期間內未測量到衰亡期。該結果與單雪梅等[9]和王開功等[14]測量的生長曲線結果不同，其原因可能是試驗方案的不同和菌株宿主來源不同。另外，本試驗未能測得衰亡期可能是因為生長后期死菌對菌液渾濁度產生影響，為了更準確地測定活菌的數量，應配合平板菌落計數法來對衰亡期菌落數進行校正。

由于蛋白質組成中常有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸，且該類氨基酸在280 nm的紫外光處有最大吸收峰[15]，故可根據280 nm處的吸光度大小來測量蛋白的含量。另外培養液中還存在核酸等成分，其最大吸收峰在260 nm，故可通過經驗公式ρ(mg/mL)=1.45×OD280 nm-0.74×OD260 nm計算蛋白濃度，排除核酸的影響。本試驗利用該方法測得牦牛源C型產氣莢膜梭菌qinghai-12的最佳產毒時間是10 h，此時蛋白質含量達4.173 mg/mL，且隨著時間的推移蛋白質含量持續增長。該結果與單雪梅等[9]測量的D 型產氣莢膜梭菌的最佳產毒時間為10 h基本一致,與王開功等[14]研究的 A 型產氣莢膜梭菌所產毒素的最佳時間8 h有所差異，可能同樣是與產氣莢膜梭菌的宿主和毒素型有關。

MIC是測量抗菌藥物的抗菌活性大小的指標之一，指在體外培養細菌18～24 h后能抑制培養基內病原菌生長的最低藥物濃度，可以直觀地了解病原菌的耐藥性。本試驗對頭孢噻肟、氨芐西林、四環素、青霉素、紅霉素、慶大霉素、多黏菌素B、復方新諾明8種常見抗菌藥進行MIC測定，結果顯示：牦牛源C型產氣莢膜梭菌qinghai-12對頭孢噻肟、氨芐西林、四環素、青霉素表現為敏感，對紅霉素表現為中度敏感，對慶大霉素、復方新諾明、多黏菌素B表現不敏感。依據牦牛源C型產氣莢膜梭菌qinghai-12來源地為青海，分析該地區可能存在慶大霉素、復方新諾明和多黏菌素B的濫用情況，推薦該地區疑似該菌感染動物優先選用頭孢噻肟、氨芐西林、四環素、青霉素類藥物，對紅霉素的使用需慎重，必要時交叉用藥，避免耐藥性的產生。

綜上所述，本試驗復蘇菌株為牦牛源C型產氣莢膜梭菌，其生長特性符合梭菌生長規律，在梭菌增菌培養基中培養10 h達到最佳產毒時間，且對慶大霉素、復方新諾明和多黏菌素B耐藥，對今后牦牛源產氣莢膜梭菌后續研究及防治等方面具有一定的指導意義。