2021年北京市野生天鵝死亡案例的診斷及其H5N8禽流感病毒的遺傳變異分析

吳 迪 ， 張啟龍 ， 馬志軍 ， 韋海濤 ， 徐發榮 ， 李 揚 ， 高曉龍 ， 王 培 ， 程汝佳 ， 王慧強 ， 劉曉冬 ， 羅伏兵

(北京市動物疫病預防控制中心 ， 北京 大興 102629)

2021年2月北京市海淀區圓明園遺址公園內3只野生黑天鵝異常死亡，本試驗對送檢病死黑天鵝樣品進行病毒分離，鑒定為H5N8亞型禽流感病毒，根據基因序列分析和雞胚死亡時間判定為高致病性毒株，通過病毒表面HA基因的同源性比較和遺傳進化分析，顯示該毒株屬于2.3.4.4分支。水禽是禽流感病毒眾多譜系的主要宿主，在這些譜系的禽流感病毒保存和傳播過程中發揮極為重要的作用[1]，本試驗為摸清該病毒傳入來源和制定科學防控措施提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 MagaBio plus病毒DNA/RNA純化試劑盒，購自杭州博日科技股份有限公司，批號：20200101；禽流感病毒H5N8亞型RNA檢測試劑盒，購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司，批號：P572201013。

1.2 臨床剖檢 對3只病死黑天鵝按常規方法進行剖檢，觀察各組織器官病變，并取疑似病變組織器官進行下一步實驗室檢測。

1.3 實驗室檢測 樣品提取核酸后使用禽流感病毒H5N8亞型RNA檢測試劑盒進行禽流感病毒H5N8亞型熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測。

1.4 病毒分離 由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所對北京市動物疫病預防控制中心送檢的1只死亡天鵝肺臟和1只死亡黑天鵝脾臟樣品剪碎后，接種SPF雞胚，進行禽流感病毒的分離鑒定。

1.5 基因組測序與分析 通過GISAID數據庫查找禽流感病毒，IRD Influenza Research Database分析網站對蛋白質序列進行特征性位點分析，并將H5N8亞型全基因組序列BLAST進行多序列比對分析，MEGA 7.0構建HA和NA基因進化樹，進行遺傳演化樹分析。

2 結果

2.1 臨床剖檢 結果顯示，3只病死黑天鵝頭部和面部水腫；角膜充血，一側失明；喉頭點狀出血，消化道、呼吸道黏膜廣泛充血、出血；胰腺點狀出血，肝臟腫大、壞死，肺部淤血；腺胃乳頭出血，腺胃和肌胃之間交界處可見壞死灶；心冠和腹部脂肪出血。上述臨床剖檢病理變化與典型的高致病性禽流感病理變化相符，臨床初步判定為疑似高致病性禽流感病毒感染。

2.2 實驗室檢測 取3只病死黑天鵝肺臟組織進行核酸提取，熒光定量RT-PCR擴增檢測結果為禽流感病毒H5N8亞型(圖1)。

圖1 組織樣品的熒光定量RT-PCR檢測Fig.1 Fluorescence quantitative RT-PCR detection of tissue samples1～3:H5亞型陽性； 4～6：N8亞型陽性; 7～9：陽性對照； 10～12：陰性對照1-3:H5 subtype positive; 4-6:N8 subtype positive; 7-9:Positive control; 10-12:Negative control

2.3 病毒分離 從1只死亡天鵝肺臟和1只死亡黑天鵝脾臟樣品中均分離到H5N8亞型禽流感病毒。

2.4 基因序列測定和特征性位點分析 分離獲得的病毒株命名為A/Wild Swan/Beijing/YMY06/2021(H5N8)，通過全基因組測序后進行BLAST比對分析，結果顯示，分離毒株HA基因與A/mallard/Kagoshimma/KU-d89/2021毒株相似度最高，為99.77%；與A/Astrakhan/3212/2020毒株相似度為99.41%。分離毒株NA基因與A/Cygnus columbianus/Hubei/51/2020(H5N8)毒株相似度最高，為99.43%。對HA節段氨基酸序列分析顯示，分離到的病毒HA蛋白裂解位點氨基酸序列為KRRKR/GLF，具有5個連續性堿性氨基酸，結合雞胚死亡時間，鑒定為高致病性禽流感病毒。該病毒HA蛋白含有7個潛在糖基化位點，NA蛋白含有5個潛在糖基化位點(表1)。

表1 A/Wild Swan/Beijing/YMY06/2021(H5N8)潛在糖基化位點分析Table 1 Analysis of potential glycosylation sites of A/Wild Swan/Beijing/YMY06/2021(H5N8)

該分離毒株氨基酸位置的確定參照A/Aichi/2/1968 (H3N2)毒株順序，病毒特殊氨基酸位點分析見表2，具有典型的禽型α2-3受體結合位點226Q、228G和138A。

表2 A/Wild Swan/Beijing/YMY06/2021(H5N8)特殊氨基酸位點分析Table 2 Analysis of special amino acid sites of A/Wild Swan/Beijing/YMY06/2021(H5N8)

2.5 基因遺傳進化分析 對A/Wild Swan/Beijing/YMY06/2021(H5N8)毒株全基因組序列進行遺傳進化分析。HA基因進化樹結果顯示，分離毒株與A/mallard/Kagoshimma/KU-d89/2021毒株高度同源，均屬于clade 2.3.4.4分支(圖2)。NA基因進化樹結果顯示，分離毒株屬于clade 2.3.4.4分支Gochang-like群(圖3)。

圖2 分離毒株HA基因進化樹Fig.2 HA gene evolution tree of isolated virus strain●:本試驗分離病毒株；下同●：Virus strain isolated in this study. The same as below

圖3 分離毒株NA基因進化樹Fig.3 NA gene evolution tree of isolated virus strain

3 討論

禽流感的流行病學非常復雜，禽流感病毒不斷通過突變和重組進化，出現新的亞型，對動物健康和生產造成重大影響[2]。本試驗分離到的H5N8亞型高致病性禽流感病毒屬于2.3.4.4分支，與日本、俄羅斯的毒株基因相似性很高，與2021年山東、2020年湖北毒株高度同源，分析該病毒可能發生了不同亞型的重配現象，并且有洲際重配的可能性[3]。

HA蛋白與宿主表面受體結合能力的強弱決定著禽流感病毒能否感染宿主，而唾液酸受體結合區(Receptor binding domain,RBD)對受體結合起著關鍵作用[4]。A型流感病毒宿主特異性與HA蛋白RBD上的氨基酸位點密切相關，HA蛋白可以識別α-2，3和α-2，6半乳糖連接的2種唾液酸受體類型[5]，人類上呼吸道上皮表面含有α-2，6半乳糖連接的唾液酸受體，禽類呼吸道細胞含有α-2，3半乳糖連接的唾液酸受體[6]，人流感病毒易與α-2，6受體結合，禽流感病毒易與α-2，3受體結合。流感病毒進化過程中HA蛋白第134位(G)、第136位(S)和第153位(W)氨基酸很保守，而第226位和第228位氨基酸最易發生突變，引起宿主特異性的改變[7]。本試驗分離病毒具有典型的禽型α2-3受體結合位點226Q、228G和138A。該毒株具備高致病性禽流感病毒的分子特征，HA蛋白含有7個潛在糖基化位點，HA 受體結合區糖基化位點158 N的缺失，可能導致病毒對α-2，6受體的親和力增加[8]，應引起重視。

高致病性禽流感病毒HA基因裂解位點處含有多個堿性氨基酸，這種裂解位點可以被宿主細胞內普遍存在的類枯草桿菌蛋白酶識別并裂解，使病毒可以進入全身多種類型細胞并進行復制，因此高致病性禽流感病毒感染宿主后，常導致全身性感染。本試驗分離病毒的HA蛋白裂解位點氨基酸序列為KRRKR/GLF，具有5個連續性堿性氨基酸，鑒定為高致病性禽流感病毒。

在全球候鳥遷徙路線中我國有3條，分別為東非—西亞遷徙路線、中亞—印度遷徙路線以及東亞—澳大利亞遷徙路線，每年從我國過境的候鳥種類和數量約占遷徙候鳥的20%～25%，北京處于東亞—澳大利亞遷徙路線上，是眾多候鳥春秋兩季遷徙的必經之路。僅在2020年初的候鳥遷徙高峰期，全市88個候鳥監測站共監測到鳥類上百萬只，同比增加30多萬只，由此推測野禽攜帶病毒繼而引發疫情的風險較大[9]。

目前，H5亞型高致病性禽流感疫情仍在歐洲、亞洲和非洲蔓延，導致受感染場所內的禽鳥死亡和撲殺，給養殖業造成巨大的經濟損失。更有可能的是，這些暴發中的傳染源可通過野鳥在當地傳播。因此，對野鳥進行監測，提高養殖場生物安全等措施是防控的關鍵[10]。