仙靈骨葆膠囊治療絕經后骨質疏松癥的生物信息學和網絡藥理學分析和實驗驗證

柴 爽 楊巖冰 馬江濤 郭云鵬 滕軍燕 秦 娜 張 虹

(河南省洛陽正骨醫院/河南省骨科醫院，鄭州，450016)

骨質疏松癥(Postmenopausal Osteoporosis，PMOP)是一種以骨量低下，骨組織微結構損壞，導致骨脆性增加，易發生骨折為特征的全身性骨病。PMOP分為原發性和繼發性兩大類，其中絕經后PMOP占比最大。調查顯示，我國40～49歲人群PMOP患病率為3.2%，50歲以上人群PMOP患病率為19.2%[1]。世界衛生組織統計表明絕經后PMOP一般發生在女性絕經后5～10年內，在世界范圍內，年齡超過50歲的女性中，每2名女性就有1名會受到骨質疏松性骨折的影響[2-3]。

PMOP最嚴重的后果是骨質疏松性骨折，至2050年我國的骨質疏松性骨折患病數可能高達599萬人[4]。因此，重視PMOP的防治具有重大意義。中醫藥防治PMOP歷史悠久[5]，仙靈骨葆膠囊(Xian-ling-gu-bao Capsule，XLGB，國藥準字Z20025337)作為PMOP類處方藥品被列入《國家基本藥物目錄》，被推薦用于絕經后PMOP[1]和老年PMOP[6]。XLGB藥物組成包括淫羊藿、續斷、補骨脂、熟地黃、丹參和知母，具有滋補肝腎，活血通絡，強筋壯骨之功效。本研究采用生物信息學和網絡藥理學分析XLGB治療絕經后PMOP的可能機制，并進行動物實驗驗證。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 數據庫 高通量基因表達(Gene Expression Omnibus，GEO)數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[7]和BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[8]。

1.2 方法

1.2.1 GEO芯片數據分析絕經后PMOP相關靶點 首先從GEO數據庫中以“osteoporosis”為關鍵詞，條目類型選擇“Series”、研究類型選擇“Expression profiling by array”,種屬選擇“Homo sapiens”進行搜索，得到GSE56815的芯片數據及其對應的分析平臺文件GPL96。該芯片數據對具有高低不同骨密度的80名絕經前后女性血液單核細胞進行基因測序。其次利用Perl軟件(V5.30.0)對芯片數據矩陣進行注釋及分組，數據注釋時將基因探針名改為相應的基因名，數據分組時將絕經前后高骨密度樣本視為正常組40例，絕經前后低骨密度樣本視為病例組40例。最后運用R軟件及limma包和pheatmap包，對數據矩陣進行矯正及差異分析，得到GEO數據庫差異火山圖。其中篩選條件P值<0.05,差異倍數(Fold Change，FC)>1。

1.2.2 XLGB中活性成分的篩選及靶點預測 本研究首先檢索可供查詢中藥、中藥活性成分及相應靶點等信息的TCMSP和BATMAN-TCM數據庫獲得補骨脂、淫羊藿、續斷、熟地黃、丹參、知母6味中藥的活性成分及相應靶點。其中篩選條件為口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，藥物類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18[9]。然后采用Perl軟件將中藥活性成分與相應靶點進行一一映射，并為篩選出的靶點添加基因名。

1.2.3 XLGB調控網絡的構建 將絕經后PMOP疾病靶點和XLGB活性成分靶點利用Perl軟件進行一一映射，得到中藥活性成分與疾病的共同靶點，然后利用Cytoscape軟件(V3.7.1)進行網絡可視化，得到活性成分-靶蛋白調控網絡。其中節點的類型有活性成分、靶點。

1.2.4 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建和關鍵靶點篩選 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網絡的構建主要利用Cytoscape軟件的Bisogenet插件，關鍵靶點篩選利用Cytoscape軟件的CytoNCA插件。將1.2.3得到的活性成分與疾病的交集靶點利用Cytoscape軟件的Bisogenet插件繪制PPI網絡。由于所得PPI網絡龐大，因此利用Cytoscape軟件的CytoNCA插件進行網絡拓撲分析，以便篩選關鍵靶點。其中篩選條件為自由度(Degree，DC)>61，中心中介性(Betweenness，BC)>600[9]?！肮濣c”(Node)表示基因，“邊”(Edge)表示基因之間的相互關系，連接邊越多的節點，表明這個節點在網絡中越重要。

1.2.5 XLGB活性成分和疾病共同靶點的富集分析 利用R語言計算1.3得到的XLGB活性成分與絕經后PMOP的共同靶點，得到基因本體(Gene Ontology，GO)生物過程富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。以P<0.05為差異有統計學意義。然后利用Cytoscape軟件將共同靶點和顯著富集的KEGG通路進行網絡可視化分析。GO功能富集分析主要包括生物過程(Biological Process,BP)，細胞組分(Cellular Component，CC)和分子功能(Molecular Function，MF)3部分。

1.3 動物實驗驗證

1.3.1 動物 無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級12周齡雌性SD大鼠32只，購自河南省實驗動物中心，合格證號SCXK(豫)2017-0001。所有實驗方案均經河南省洛陽正骨醫院動物實驗倫理委員會批準。

1.3.2 藥物 XLGB(國藥集團同濟堂制藥有限公司，國藥準字Z20025337)，戊酸雌二醇片(拜耳醫藥保健有限公司，國藥準字J20171038)

1.3.3 試劑與儀器 BCA蛋白濃度測定試劑盒、Western及免疫沉淀裂解液(上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0010、P0013B)，大鼠血清活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號：S003S)，TUNEL試劑盒(Roche，瑞士，批號：11684817910)，B細胞淋巴瘤-2(B-cell-2,Bcl-2)和Bcl-2對抗殺手蛋白(Bcl-2-antagonist/killer Protein，Bak)抗體(CST，美國，批號：2870和12105)，β-actin抗體、羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗(武漢三鷹生物技術有限公司，批號：20536-1-AP、SA00001-2-500和SA00001-1-500)。

1.3.4 分組與模型制備 將32只大鼠隨機分為假手術組，模型組，XLGB組，戊酸雌二醇組4組，每組8只，采用去卵巢法造模。

1.3.5 給藥方法 造模術后1個月灌胃給藥，給藥劑量按照人與大鼠體表面積折算，戊酸雌二醇組給藥劑量為0.104 mg/kg，XLGB組給藥劑量為0.25 g/kg，假手術組和模型組給予等體積生理鹽水，灌胃3個月后收集標本。

1.3.6 檢測指標與方法 檢測大鼠腰椎骨密度，取大鼠血清檢測活性氧水平，取右側股骨遠端進行TUNEL染色，左側股骨遠端提取總蛋白，采用蛋白質免疫印跡法檢測Bcl-2、Bax表達。

2 結果

2.1 PMOP靶點的篩選 利用GEO芯片數據，進行絕經前后高骨密度樣本組和絕經前后低骨密度樣本組基因的差異表達分析，共發現883個基因存在組間差異表達，其中表達上調基因424個，表達下調基因459個。見圖1。

圖1 差異表達基因的火山圖

2.2 XLGB活性成分的篩選及靶蛋白預測 共獲得119種活性成分，其中淫羊藿活性成分23種、續斷活性成分8種、補骨脂活性成分6種、熟地黃活性成分2種、丹參活性成分65種、知母活性成分15種。共收集活性成分所對應的靶蛋白1 734種。

2.3 XLGB活性成分-共同靶點調控網絡 將PMOP靶點與XLGB活性成分對應的靶蛋白取交集后得到26個共同靶點，所對應的XLGB中活性成分共61種。其中，淫羊藿活性成分7種、續斷活性成分1種、補骨脂活性成分3種、丹參活性成分43種、知母活性成分3種，多味中藥(2味及以上)共有的活性成分4種。見圖2。

圖2 XLGB活性成分-靶蛋白調控網絡

2.4 共同靶點PPI網絡的構建和關鍵靶點篩選 共得到3 916個節點和69 974個邊，這表明XLGB可能影響3 916個與PMOP相關的基因，而這3 916個基因之間可以產生69 974種直接或間接的相互作用。設置DC>61，BC>600，得到152個節點和3 832個邊。表明XLGB可能影響與PMOP相關的152個基因。見圖3。

圖3 XLGB調控PMOP的關鍵靶點

2.5 XLGB活性成分和疾病共同靶點的富集分析 如圖4所示，顯著富集到BP的GO條目有調控結合與負調控結合，細胞氧化應激反應，對營養水平的反應，調控膜電位，巨噬細胞源性泡沫細胞分化，泡沫細胞分化，興奮性突觸后電位，神經元死亡等。

圖4 XLGB活性成分和疾病共同靶標的基因本體論

顯著富集到CC的GO條目有分泌性顆粒、胞質囊腔、囊腔、肽酶復合物、膜筏、膜微結構域、膜區、紡錘體、特殊顆粒等。顯著富集到MF的GO條目有蛋白激酶C結合、輔因子結合、BH域結合、死亡域結合、酰胺結合、硫化物結合、脂肪酰輔酶A結合、脂肪酸衍生物結合、膽固醇結合等。如圖5所示，顯著富集的信號通路包括細胞凋亡信號通路，破骨細胞分化信號通路，cAMP信號通路，MAPK信號通路，細胞衰老信號通路，cGMP-PKG信號通路，VEGF信號通路，壽命調節信號通路，內分泌抵抗信號通路，HIF-1信號通路等。然后，利用，共有15個共同靶點通過調控13個信號通路來影響PMOP的發生。其中，AKT1、JUN、NFKB1，NFKBIA、PPP3CA、BAX等靶點的作用較大。見圖6。

圖5 XLGB活性成分和疾病共同靶點的KEGG通路富集分析

圖6 XLGB活性成分-信號通路網絡

2.6 XLGB對去卵巢大鼠細胞凋亡的影響 綜合上述分析，動物實驗重點關注XLGB對PMOP細胞凋亡的影響。如表1所示，腰椎骨密度結果顯示2種藥物干預后，均可明顯改善去卵巢引起的骨密度降低(P<0.05)，與假手術組比較，OVX組活性氧水平顯著升高(P<0.05)，藥物干預后，戊酸雌二醇組血清雌激素水平有所下降，但差異無統計學意義(P>0.05)，XLGB組活性氧水平明顯降低(P<0.05)。

表1 XLGB對骨密度、血清活性氧的影響

對股骨遠端骨組織進行TUNEL染色及凋亡率測定，模型組TUNEL陽性細胞增多，藥物干預后各組TUNEL陽性細胞顯著減少(P<0.05)。模型組Bcl-2水平降低(P<0.05)，Bax升高(P<0.05)。藥物干預后，與模型組比較，XLGB組和戊酸雌二醇組Bcl-2水平顯著增加，Bak水平顯著降低(P<0.05)。見圖7。

圖7 仙靈骨葆膠囊對細胞凋亡的影響

3 討論

中醫學將PMOP歸屬為“骨痿”范疇，最新的中醫藥專家共識認為PMOP主要是由于絕經后婦女腎精不足等因素導致骨失滋養的全身性慢性骨骼疾病[1]，是一種與增齡相關的疾病。女子七七之后，人的體質特點以任脈虛，太沖脈衰少，精少，腎臟衰，天癸竭之“虛”象和地道不通，形體皆極之“瘀”象為主，此時發為本病多為本虛標實之證，病變臟腑為脾、肝、腎，氣滯血瘀為其表證。醫家對本病的中醫病機辨證，多從腎虛、脾虛、血瘀進行辨證，或以腎虛為主，兼顧脾虛、血瘀，或分而論治。常用辨證分型為脾腎陽虛證、肝腎陰虛證和腎虛血瘀證，對于脾腎陽虛證，治宜溫補脾腎，強筋壯骨，專家共識推薦使用XLGB加文獻。臨床實踐表明XLGB治療PMOP在改善腰椎骨密度、提高臨床有效率及改善疼痛方面療效確切，同時，XLGB聯合單一抗骨質疏松藥物具有增效作用，而其與2種或以上抗骨質疏松藥物聯用疊加增效作用尚待研究[10]。

近年來，開展了許多XLGB治療PMOP的基礎研究，發現XLGB可通過調節骨形成蛋白-2(Bone Morphogenetic Protein，BMP)-2、BMP-4、蛋白激酶C和轉化生長因子β1來提高去卵巢大鼠骨密度[11]，可通過提高去卵巢大鼠股骨骨折周圍軟組織血小板衍生生長因子、轉化生長因子β-β和血管內皮生長因子進骨折愈合[12]，可顯著降低骨周轉率、促進成骨及抑制脂肪生成、促進骨小梁結構改善[13]，可能通過參與去勢大鼠組蛋白修飾改善PMOP癥狀。但這些研究僅從單一方面關注XLGB的可能作用機制，未進行其物質基礎的探索。本研究采用生物信息學和網絡藥理學的方法，篩選PMOP相關差異表達基因，對XLGB的有效活性成分進行篩選，并預測可能的作用靶點，對共同靶點進行網絡構建和富集分析，以期闡明XLGB治療PMOP的靶點和作用機制。

利用生物信息學方法挖掘GEO芯片數據，共發現883個與PMOP發生發展相關的靶點。通過檢索TCMSP和BATMAN-TCM數據庫，共獲得XLGB的119種活性成分，將疾病相關靶點與活性成分對應的靶蛋白取交集后得到26個共同靶點，共對應61種XLGB活性成分，調控網絡圖說明XLGB中的61種活性成分可以單獨或共同作用于影響PMOP發生的26種基因中的一個或多個，對這些共同靶點進行PPI網絡分析發現其與PMOP相關的152個節點PPI，表明XLGB可能間接通過影響這些蛋白質發揮抗PMOP的作用，這些可以解釋中草藥的多效性，體現了中藥“多組分、多靶點”的作用機制[14]。

對共同靶點的GO富集分析顯示，XLGB調控PMOP相關靶蛋白主要富集在細胞氧化應激反應，對營養水平的反應，分泌性顆粒，蛋白激酶C結合，BH域結合等，其中細胞氧化應激反應，BH域結合與PMOP發生發展過程中成骨細胞凋亡密切相關。雌激素缺乏等凋亡信號可激活內源性線粒體途徑，促凋亡蛋白BH3-only上調，從而抑制抗凋亡的Bcl-2家族成員。如果所有可用的抗凋亡蛋白都被BH3-only蛋白隔離，促凋亡蛋白Bax和BCL-2 Antagonist/Killer 1(Bak1)被活化后聚集在線粒體外膜形成同源寡聚體或自發寡聚化，促進1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)開放或直接在線粒體外膜穿孔，破壞線粒體外膜，釋放細胞色素C到細胞質[15]，激活胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-3等，切割DNA修復酶多腺苷二磷酸核糖聚合酶[16]，導致成骨細胞凋亡的發生。說明XLGB可以對該過程進行調控，KEGG通路富集結果中細胞凋亡信號通路富集了7個基因且顯著性最強，亦佐證了這一結論。利用Cytoscape軟件將共同靶點和顯著富集的KEGG通路進行網絡可視化分析，發現AKT1、NFKB1、BAX等靶點處于中心位置，這些可能是仙靈骨葆膠囊治療PMOP的關鍵作用靶點。

實驗驗證部分建立去卵巢大鼠模型，通過檢測骨密度、血清活性氧水平、骨組織凋亡率及凋亡相關鍵蛋白，驗證XLGB影響細胞凋亡治療PMOP。首先骨密度結果與既往研究結果一致[11，17]，XLGB可有效改善去卵巢大鼠腰椎骨密度。PMOP的發生與雌激素水平驟然下降活性氧產生增多密切相關[18-19]，XLGB干預后血清活性氧明顯下降。病理染色結果同樣提示，XLGB干預后，股骨遠端骨組織細胞凋亡率明顯降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表達量升高，而促凋亡蛋白Bax表達量顯著下降，提示XLGB可能通過清除活性氧影響細胞凋亡發揮抗PMOP作用。

綜上所述，本研究采用生物信息學和網絡藥理學的方法，分析了XLGB治療PMOP的作用機制，并進行動物實驗，驗證XLGB通過影響細胞凋亡發揮治療作用，為深入研究藥物作用的分子機制和藥效物質基礎奠定基礎。本研究的局限性在于XLGB具有多通路、多靶點的作用特點，本研究僅進行了凋亡信號通路的驗證，未明確其對上游信號通路的作用，因此后續將針對這方面展開探索。