基于網絡藥理學與實驗驗證研究小兒咽扁顆粒治療急性咽炎的作用機制

張可可 陳建新 趙慧輝 賈彩霞 李韶菁

(1 中國中醫科學院中藥研究所，北京，100700； 2 長沙衛生職業學院，長沙，410100； 3 北京中醫藥大學，北京，100029)

咽炎(Pharyngitis)是一種常見的感染性疾病，即在咽部發生了炎癥反應。當寄生在咽部的溶血性鏈球菌作為其致病菌引起時，若得不到及時的治療，有可能會發生風濕性心臟病、感染性心內膜炎、風濕性關節炎等一系列嚴重并發癥。因此，對咽炎的及時治療刻不容緩。Symmap數據庫，是由實驗室與中國科學院自動化研究所合作研發的綜合類大型網絡平臺，它是第一個公開包含全面信息的可視化數據庫，這些信息包括：關于中醫癥狀之間的關系，中醫證候和中草藥。Symmap數據庫對于藥理作用的研究、中藥活性成分的尋找、中藥機制的研究有著至關重要的意義[1]。課題組前期研究表明小兒咽扁顆粒對大鼠25%氨水噴霧急性咽炎模型有著良好的抗炎作用，本文利用網絡藥理學這一方法，分析其起效機制。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學分析

1.1.1 小兒咽扁顆粒所含成分的收集與篩選 小兒咽扁顆粒主要由金銀花、玄參、麥冬、桔梗、金果欖、射干、牛黃、冰片8味中藥組成，具有清熱利咽、解毒止痛的功效[2]。由于受目前分離、提純工藝技術的限制，中藥所含化學成分十分復雜，通過檢索數據庫、分析文獻來搜集其有效成分。通過查閱和調研國內外文獻，同時在實驗室新開發的通過癥狀繪圖增強的中醫綜合Symmap數據庫(http://www.symmap.org/)[1]、中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)收集小兒咽扁顆粒的中藥化學成分，并對收集到的化合物進行篩選。按文獻報道來設置篩選條件，篩選條件為“口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18”[4]。有些數據庫中缺失的化合物，則按文獻報道[5]進行增補，將與炎癥相關的中藥有效成分加入進來。最后，將篩選后的化合物與增補后的化學成分進行匯總。

1.1.2 小兒咽扁顆粒中藥-化學成分網絡構建與分析 通過利用Cytoscape 3.5.1軟件對小兒咽扁顆粒的中藥-化學成分進行網絡構建。此網絡代表小兒咽扁顆粒內8味中藥與其有效成分之間的關系。

1.1.3 小兒咽扁顆粒中化學成分相關靶點的獲取 在Symmap數據庫、TCMSP數據庫中檢索小兒咽扁顆粒所含8味中藥成分，并通過中藥成分，找到相關的靶點蛋白，并在Symmap數據庫中找到其相應的基因型表型。

1.1.4 咽炎相關靶點獲取 在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、在線《人類孟德爾遺傳》(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)(http://www.omim.org/)[3]數據庫中檢索與咽炎相關的靶點蛋白。搜索的關鍵詞為咽炎，在這2個數據庫中對關鍵詞進行搜索，以檢索到相應的疾病靶點蛋白，并在Symmap數據庫中找到其相應的基因型表型。

1.1.5 中藥有效成分相關靶點與咽炎相關靶點的相互映射 在GeneCards數據庫搜索咽炎相關蛋白，與小兒咽扁顆粒的靶點進行映射，得到小兒咽扁顆粒治療咽炎的共同靶點。

1.1.6 映射后的靶點蛋白相互作用網絡構建、核心靶點的尋找 運用Cytoscape 3.5.1軟件構建，制作出“中藥-化學成分-靶點”網絡圖。運用String 11.0、Cytoscape構建映射后的靶標之間的相互作用網絡圖，靶標之間的連線代表二者之間的相互作用。通過使用Cytoscpe自帶軟件找出核心靶點。

1.1.7 小兒咽扁顆粒治療急性小兒咽炎預測靶標富集分析 使用映射后的基因型表型，在功能注釋生物信息學微陣列分析(Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis，DAVID 6.8)數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)數據庫中獲得基因相關的通路富集分析，包括體內生物過程的通路分析以及基因本體(Gene Ontology,GO)通路分析。

網絡藥理學部分結果由Symmap數據庫、TCMSP、人類基因數據庫(GeneCards)、在線人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)、uniprot數據庫、DAVID 6.8數據庫、Omicshare(http://www.omicshare.com/)自動計算P值(P<0.05)生成。

1.2 動物實驗驗證

1.2.1 動物 Sprague Dawley大鼠60只(SPF)，雌雄各半，體質量180～220 g。三級實驗室屏障環境飼養，動物購于北京百諾威生物科技有限公司，許可證號SCXK(京)。實驗方案實施前獲得中國中醫科學院中藥研究所實驗動物管理和使用委員會的審核和批準(倫理審批號：2018B154)。

1.2.2 藥物 小兒咽扁顆粒[華潤三九(黃石)藥品有限公司，批號:1803007Z]、阿司匹林腸溶片(拜耳醫藥保健有限公司，批號：BJ38903)、高活性干酵母(安琪酵母有限公司)、生理鹽水(石家莊四藥有限公司，批號：1409143203)。

1.2.3 試劑與儀器 腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，批號：R180710-102a)、白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，批號：R180710-003a)、IL-1β試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，批號：R180710-007a)；醫用電子體溫計(邁克大夫，型號:MT1961)、酶標儀(SUNRISE，瑞士，型號:16039400)。

1.2.4 分組與模型制備 將根據給藥方法分為正常組、模型組、阿司匹林組、小兒咽扁顆粒低劑量組、小兒咽扁顆粒中劑量組、小兒咽扁顆粒高劑量組。每組10只。大鼠禁食不禁水8 h，每小時測體溫1次，連續2次，選體溫變化不超過0.3 ℃的動物備用，平均體溫作為正常體溫。給留用大鼠背部皮下注射20%酵母懸液10 mL/kg，6 h后測定體溫，選取體溫升高0.8 ℃以上大鼠作為實驗動物。

1.2.5 給藥方法 小兒咽扁顆粒配制方法：使用時以無菌生理鹽水配制成混懸液，現用現配；阿司匹林腸溶片配制方法：稱取阿司匹林腸溶片300 mg，加入適量蒸餾水研磨成均勻的混懸液，并定容至100 mL，即得阿司匹林混懸液，現用現配；25%干酵母懸液配制方法：稱取高活性干酵母10 g置于研缽中，加入適量蒸餾水研磨成均勻的混懸液，并定容至50 mL，即得20%干酵母懸液，現用現配。各組采取灌胃給藥，模型組按照10 mL/kg劑量給予生理鹽水、阿司匹林組按200 mg/kg給予阿司匹林混懸液，小兒咽扁顆粒組分別給予低劑量(3 g/kg)、中劑量(6 g/kg)、高劑量(12 g/kg)小兒咽扁顆粒混懸液。正常組不給藥。

1.2.6 檢測指標與方法 1)測基礎體溫:取大鼠置于恒溫的實驗室環境中，每天用蘸有少量液狀石蠟的體溫計輕輕插入肛門內2 cm測肛門溫度(體溫)，連續3 d使適應環境和測溫刺激。各組灌胃給藥，分別于給藥后0.5、1、2、4、6 h測定肛門溫度。給藥前體溫為發熱體溫。2)炎癥介質水平：給藥后6 h后，腹主動脈采血，取血清，進行炎癥介質測定。

2 結果

2.1 小兒咽扁顆粒所含成分的收集與篩選 小兒咽扁顆粒中收集到了97個化學成分滿足篩選條件，其中金銀花23個、射干17個、金果欖10個、玄參9個、桔梗7個、牛黃15個、冰片3個、麥冬13個。其中金銀花所含的化學成分數量最多，占全方總化學成分數量的23.7%；排名第2位的是射干，所含化學成分數量占全方總化學成分數量的17.5%，排名第3位的是牛黃，所含化學成分數量占全方總化學成分數量的15.5%。

2.2 小兒咽扁顆粒中藥-化學成分網絡構建與分析 如圖1所示，黃色的方框代表小兒咽扁顆粒里的8味中藥，分別為金銀花、玄參、麥冬、桔梗、金果欖、射干、牛黃、冰片；藍色方框代表每個中藥中的化學成分(金銀花23個、射干17個、金果欖10個、玄參9個、桔梗7個、牛黃15個、冰片3個、麥冬13個)，連線表示化學成分與中藥的所屬關系，小兒咽扁顆粒中每一味中藥所包含的化學成分，共97個。表1為圖1中各化學成分的具體名稱。其中谷固醇(Beta-sitosterol)為金銀花、麥冬、玄參所共同包含；木樨草素(Luteolin)為金銀花、桔梗、射干所共同包含；豆甾醇(Stigmasterol)為金銀花、射干所共同包含。

表1 化學成分編號對應名稱

圖1 小兒咽扁顆粒中所含中藥及其化學成分網絡關系圖

2.3 中藥-化學成分-靶點網絡構建與分析 該網絡包含311個節點和675條邊，97個化合物的網絡的節點自由度為4.341。見圖2。

圖2 小兒咽扁顆粒治療炎癥疾病的中藥-化學成分-靶點網絡關系

2.4 成分靶點相互作用網絡構建與分析 治療咽炎的相關蛋白，與小兒咽扁顆粒的靶點進行映射，得到107個小兒咽扁顆粒治療咽炎的靶點，并找到作用于這些靶點的成分。見表3。對映射后的靶點構建網絡圖。見圖3。MYST組蛋白乙酰轉移酶(單核細胞白血病)4[MYST Histone Acetyltransferase(Monocytic Leukemia)4，MYST4]、三磷酸腺苷結合盒亞家族A成員1(ATP-binding Cassette Sub-family A Member 1，ABCA1)、視黃酸受體α(Retinoic Acid Receptor Alpha，RARA)、與Runt相關轉錄因子1(Runt-related Transcription Factor 1，RUNX1)為核心靶點。核心化合物是隱黃素(Kryptoxanthin)。見表2。

圖3 小兒咽扁顆粒治療炎癥疾病的成分靶點相互作用網絡與核心靶點關系圖

表2 小兒咽扁顆粒治療咽炎的核心靶點

表3 小兒咽扁顆粒治療咽炎靶點對應成分

2.5 金銀花、射干靶點分析與差異性基因分析 如圖4所示，金銀花和射干共同含有的治療炎癥的靶標蛋白數量為8個，占靶標蛋白的7.8%；其中金銀花獨有的靶標蛋白數為91個，占總靶標蛋白的89.2%；射干獨有的靶標蛋白數為3個，占總靶標蛋白的2.9%。小兒咽扁顆粒中，金銀花的靶標蛋白數目占全方治療炎癥疾病總靶點蛋白數目的41.5%。而排名第2位的牛黃和排名第3位的射干的靶標蛋白數目分別占全方治療炎癥疾病總靶點蛋白數目的41.5%。其余7味中藥治療炎癥疾病的靶點蛋白數占全方治療炎癥疾病總靶點蛋白數目的18.2%和17.7%，在數量上遠遠低于金銀花。

圖4 金銀花與射干共有及特有的治療炎癥的靶點分析

2.6 小兒咽扁顆粒治療咽炎靶點的生物過程、富集分析 對小兒咽扁顆粒與炎癥相關的107個目標靶點進行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析和GO生物過程分析。其中，排位前20位的GO生物過程與KEGG通路分析如圖5、圖6所示。在GO分析中，對藥物的反應、對乙醇的反應、凋亡過程的負調控、轉錄過程的正調控、基因表達的正調控、對雌二醇的反應、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控等排位靠前。在KEGG通路分析中顯示，小兒咽扁顆粒治療咽炎的機制可能與腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)信號通路、叉頭框O(Forkhead Box O,FoxO)信號通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase/serine-threonine Protein Kinase,PI3K/AKT)信號通路、缺氧誘導因子-1(Hypoxia-inducible Factor-1,HIF-1)信號通路、T細胞受體信號通路、P53信號通路、核轉錄因子(Nuclear Factor Kappa B，NF-κB)信號通路、類節點受體信號通路、Toll樣受體信號通路、酪氨酸激酶受體(Receptor Kinases Tyrosine)、ErbB信號通路、催乳素信號通路、巴爾病毒感染、促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK)信號通路、蛋白酪氨酸激酶、Janus激酶信號轉導子及轉錄激活因子(Janus Kinase/Signal Transducer and Activators of Transcription，JAK-STAT)信號通路、鞘脂類信號通路等有關。

圖5 GO生物過程分析

圖6 KEGG通路分析HTLV-1改為1型人T細胞白血病病毒

2.7 各組時間點體溫測定結果 模型組大鼠體溫顯著性升高；陽性對照藥的阿司匹林于給藥后0.5、1、2、4、6 h均可顯著降低大鼠體溫；小兒咽扁顆粒中劑量組和高劑量組于給藥后1 h和2 h，大鼠體溫呈下降趨勢。見表4。

表4 各組不同時間點體溫

2.8 各組IL-6，IL-1β和TNF-α比較 給藥6 h后，模型組IL-6，IL-1β和TNF-α均顯著性提高差異有統計學意義(P<0.01)；陽性藥阿司匹林組可顯著性降低血清中IL-6，IL-1β和TNF-α的含量差異有統計學意義(P<0.01)；小兒咽扁顆粒低劑量組、中劑量組和高劑量組對于血清中IL-6，IL-1β和TNF-α的含量呈現出下降的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討論

傳統的中藥研究方法一般是通過從原藥材中提取、分離其有效成分，再通過動物實驗、細胞實驗、分子生物學實驗、臨床試驗進行有效性和安全性等各種指征測評，最終應用于臨床診治。這種方法的優點是以實驗作為支撐，將各種情況反映出來，缺點是進程較為緩慢。近些年來，隨著互聯網技術的迅速發展，一系列通過計算機研究中藥的方法應運而生[6-10]。網絡藥理學作為生物信息學其中一種研究手段，對中醫藥化學成分復雜的復方制劑，中藥藥理的多成分、多通路、多靶點的作用特點，相較于傳統方法有著很大的優勢。

咽炎是一種感染性疾病，可由多種致病菌引起，致病菌A組溶血性鏈球菌(Group A Streptococcus，GAS)可能引起諸如急性腎小球腎炎、感染性心內膜炎、風濕性心瓣膜病、風濕性關節炎等并發癥。有循證研究表明，5歲以上兒童GAS痰培養陽性檢出率隨年齡的增加而增加[11]。因此，一旦確定感染為溶血性鏈球菌時，及時而有效的抗感染治療措施十分重要。現代醫學治療咽炎的方法一般是進行藥敏試驗，確定感染菌株，再決定是否進行抗感染治療。若進行抗感染，則使用青霉素類、大環內酯類抗生素[12]。中醫治療咽炎也有不良反應較少、價格低廉等優勢。

本文采用網絡藥理學的研究方法，通過多個角度探究了小兒咽扁顆粒治療咽炎的潛在分子機制和靶點通路。通過篩選小兒咽扁顆粒中所含的化學成分，并通過成分所尋找的靶點，與通過咽炎這一疾病所尋找的靶點相互映射，從而找到了小兒咽扁顆粒治療咽炎的靶點，并且通過計算，確定了其中起重要作用的關鍵化合物隱黃素和關鍵靶點MYST4、ABCA1、RARA、RUNX1。隱黃素是一種天然色素，可在體內轉化成為視黃醇，是一種抗氧化劑，起到保護視桿細胞的效果[13]。RARA則為隱黃素的受體[14]，涉及的疾病是急性早幼粒細胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia，APL)，其發生的機制由染色體基因的異位所引起。研究發現，ABCA1是膽固醇從周圍逆向轉運的關鍵蛋白分子，可作為治療低密度脂蛋白膽固醇血癥的關鍵靶點，起到防治心血管疾病的作用[15-16]，研究者在2017年發現了其三維結構[17]。RUNX1是在轉錄過程中的一種蛋白質，與它相關的疾病是急性髓性白血病1蛋白，相關疾病為急性髓性白血病M2型、急性淋巴性白血病、骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic Syndrome，MDS)[18]。MYST4位于10號染色體2區2帶2號，與其突變相關的疾病有子宮平滑肌瘤[19]、MDS[20]。以上結果為我們提供了更多研發中成藥治療急性咽炎乃至其他疾病，如心血管疾病、白血病等提供了新的思路和線索，對于精準醫療和轉化醫學的實施也有一定的意義。

方中金銀花和射干共為君藥，金銀花可清熱解毒、疏散風熱，射干可清熱解毒、消痰利咽；金果欖、玄參、麥冬、桔梗4味藥共為臣藥，玄參可清熱涼血，瀉火解毒，麥冬可養陰潤肺、益胃生津、清心除煩，桔梗可宣肺祛痰、利咽排膿；牛黃、冰片為佐藥，牛黃可化痰開竅、涼肝熄風、清熱解毒，冰片可開竅醒神、清熱止痛。其中金銀花、射干、金果欖、玄參、冰片在實驗中均表明有一定的抗菌作用，牛黃和麥冬有一定的抗炎作用。通過網絡分析，從數量上來看，金銀花、牛黃、射干治療咽炎的靶點蛋白數目較多，起主要作用。進一步對金銀花、射干靶點分析得出金銀花可能為小兒咽扁顆粒治療咽炎的主要藥物。這與以中醫基礎理論為指導的方劑配伍組成中的組方關系中，金銀花為君藥的配伍關系不謀而合。現代藥理發現，金銀花中的有效成分黃酮類、綠原酸類、揮發油類可以抑制革蘭氏陽性球菌、革蘭氏陰性桿菌的生長，且對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus,MRSA)也有效果；同時，通過抑制滲出、抑制增生、解熱、增強巨噬細胞的吞噬功能等過程，起到抗炎作用。

通過對小兒咽扁顆粒治療咽炎在生物過程富集分析，在GO生物過程中，對藥物的反應、對乙醇的反應、凋亡過程的負調控、轉錄過程的正調控、基因表達的正調控、對雌二醇的反應、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控等過程，與治療咽炎可能有一定的相關性。

在KEGG信號通路分析中，小兒咽扁顆粒治療咽炎的機制可能與TNF信號通路、FoxO信號通路、PI3K/AKT信號通路、HIF-1信號通路、T細胞受體信號通路、P53信號通路、NF-κB信號通路等有關。TNF信號家族包括細胞凋亡信號通路、JAK信號通路、NF-κB信號通路，主要功能是促進細胞生長、分化、誘導細胞凋亡、促進炎癥的發生。根據GO分析和KEGG分析，進一步表明小兒咽扁顆粒對急性咽炎從多方面、多層次防治急性咽炎。

通過運用網絡藥理學的方法探索了小兒咽扁顆粒治療急性咽炎的作用機制，分析了其治療的潛在物質基礎和有效靶點。發現小兒咽扁顆粒可以通過對藥物的反應、抑制細胞凋亡等過程治療咽炎，其作用機制可能與TNF、FoxO、PI3K/AKT、HIF-1、T細胞受體信號通路有關，其中TNF信號通路可能是其發揮作用的關鍵通路；關鍵化合物是隱黃素，關鍵靶點是ABCA1、RARA、RUNX1、MYST4。但是，網絡藥理學研究尚有一定的局限性，如某些化合物、靶點數據庫中還并未收錄，數據庫信息并未及時更新，中藥的品種、產地、炮制均對藥物的成分含量有一定影響，患者個體差異也對藥效有一定影響。因此，今后仍有必要對研究進行改進和深入研究。