例析幾種與PCR技術應用相關的教學疑難點

陳 國 龔一富

（1.浙江省慈溪中學 浙江寧波 315300）

（2.寧波大學海洋學院 浙江寧波 315832）

PCR技術是生物學考試中的熱點與難點。近年來，隨著PCR技術的快速發展，除常規PCR外，還衍生出了重疊延伸PCR、反向PCR、熒光定量PCR、巢式PCR、不對稱PCR、多重PCR等技術，不同的PCR技術有著不同的應用。下文選取了教學中與PCR技術相關的疑難點，并結合典型試題，探討幾種PCR技術的應用，以促進學生對PCR技術的理解，并為教師的教學提供參考。

1 利用PCR技術獲取目的基因

獲取目的基因是基因工程操作的第一步。新版高中生物學教材介紹了化學合成、借助載體建立基因文庫和通過PCR擴增DNA三種獲取目的基因的方法。由于PCR是體外的DNA擴增技術，部分學生在學習時，對如何利用PCR技術獲取目的基因存在疑問。

【例1】“X基因”是DNA分子上一個有遺傳效應的片段，若要用PCR技術特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應中加入兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結合位置如圖1A所示。經4輪循環后產物中有5種不同的DNA分子，如圖1B所示，其中第⑤種DNA分子有（ ）個。

圖1 目的基因及PCR產物

參考答案：8

難點分析：若要獲得目的基因X，至少需要3輪PCR，具體過程如圖2所示。第一輪PCR得到2個DNA片段（①和②各一分子）。第二輪PCR得到4個DNA片段（①②③④各一個）。第三輪PCR得到8個DNA片段（①②各1個，③④⑤各2個），其中⑤是等長的，即獲得2個目的基因X。同理，第四輪PCR可得到16個DNA片段，其中8個⑤，實現了目的基因的擴增。

圖2 PCR獲取目的基因

2 利用PCR技術鑒定目的基因的連接方式

檢測目的基因在受體細胞內是否穩定存在是基因工程操作的重要步驟。新版高中生物學教材介紹了借助載體上的標記基因、PCR技術和核酸分子雜交技術等方法鑒定受體細胞中是否轉入了目的基因。在實際操作中，PCR技術不僅可精準地鑒定受體細胞是否轉入目的基因，還可以通過引物的巧妙設計鑒定目的基因的連接方式。

【例2】為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質粒，擬設計引物進行PCR鑒定。圖3中A所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質粒中的相應位置，PCR鑒定時應選擇的一對引物是____。某學生嘗試用圖中另外一對引物從某一菌落的質粒中擴增出了400 bp片段，原因是______________。

圖3 重組質粒

參考答案：乙和丙 目的基因反向連接

難點分析：可以運用PCR技術檢測鑒定受體細胞中是否轉入目的基因，其簡要的步驟是，首先根據目的基因的序列設計PCR引物，接著利用待檢DNA為模板進行PCR，再通過電泳鑒定PCR產物。如圖3所示，如果用引物乙和丙，若正確連接則會產生350 bp片段，反向連接則不會出現；同理，若用引物甲和丙，無論正向連接還是反向連接均會產生450 bp片段。根據圖3中B進行分析，若采用引物甲和乙，目的基因反向連接會擴增出400 bp片段。

3 利用PCR技術引導基因定點突變

隨著PCR技術的不斷創新，在實驗中，可利用重疊延伸PCR技術引導基因定點突變，重疊延伸PCR技術是如何將兩個不同來源的DNA片段拼接的，也是學生普遍關心的問題。下面結合例題進行分析。

【例3】水蛭素是一種蛋白質，可用于預防和治療血栓。某科研團隊運用重疊延伸PCR技術在水蛭素基因中的特定位點引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺（密碼子為AAC、AAU）替換為賴氨酸（密碼子為AAA、AAG），從而提高水蛭素的抗凝血活性，原理如圖4所示。

圖4 PCR定點突變示意圖

（1）若擬突變位點的堿基對為A-T，則需要讓其突變為_____才能達到目的。引物2的突變位點（突起處）應設計為______（假設引物為單鏈DNA）。

（2）在第一階段獲得兩種具有重疊片段DNA的過程中，引物1、引物2組成的反應系統和引物3、引物4組成的反應系統中均進行一次復制，共產生__________種DNA分子。該階段必須將引物1、2和引物3、4置于不同反應系統中，這是因為_________________。

（3）利用重疊延伸PCR技術還可以將兩個不同來源的DNA片段拼接起來。有人想利用該技術把基因M和N拼接在一起，設計基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在設計這4種引物時，特別要注意的問題是___________________________。

參考答案：（1）T-A或C-G A或G （2）3引物2和引物3中存在互補片段，置于同一反應體系時會發生結合而失去作用 （3）M1、M2中的一種引物與引物N1、N2的其中一種必須具有互補配對的片段

難點分析：利用重疊延伸PCR技術實現基因定點突變的設計思路分為兩步。第一步是重疊，即用具有互補配對片段的引物（圖4中的引物2和3）分別進行PCR，獲得有重疊鏈的兩種DNA片段，對應圖4中的第一階段；第二步是延伸，即在后續的擴增反應中通過重疊鏈的延伸獲得想要的定點突變的基因，對應圖4中的第二階段。

4 利用PCR技術擴增未知基因序列

應用PCR技術進行基因擴增時，為了便于設計引物，要求目的基因兩側的序列是已知的。如果未知序列的內側是已知序列，可否利用PCR技術擴增外側的未知基因序列呢？下面結合例題進行分析。

【例4】如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR方法，簡捷地分析出已知序列兩側的序列，具體流程如圖5（以EcoRⅠ酶切為例）。

圖5 反向PCR示意圖

請據圖5回答問題。

（1）若下表所列為已知的DNA序列和設計的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的引物必須是_______（從表2引物①②③④中選擇，填編號）。

表2 DNA序列

（2）對產物測序，經分析得到了片段F的完整序列。下列單鏈序列中（虛線處省略了部分核苷酸序列），結果正確的是_______。

A.5′-AACTATGCG——AGCCCTT-3′

B.5′-AATTCCATG——CTGAATT-3′

C.5′-GCAATGCGT——TCGGGAA-3′

D.5′-TTGATACGC——CGAGTAC-3′

參考答案：（1）②④ （2）B

難點分析：由于已知序列的外側是未知序列（如圖5中待擴增的未知序列），因此無法設計引物。若要分析出已知序列兩側的未知序列，設計引物是關鍵，可以采用反向PCR技術。反向PCR的操作步驟可以分為兩步。第一步是連接成環，即用限制酶切割DNA，用DNA連接酶將其連接成環，即圖5中Ⅰ酶切和Ⅱ連接過程。第二步是反向擴增，即根據已知序列設計一對引物，以環狀DNA兩條鏈為模板，從已知序列向未知序列方向進行反向擴增，利用TaqDNA聚合酶無法將DNA連接成環的特點，得到鏈狀DNA，即圖5中Ⅲ擴增過程。本題（1）采用反向PCR擴增未知序列，又因子鏈的延伸方向從5′-3′，可根據已知序列3′-AGTACTCGCGTATCAA-5′和 3′-CGTTACGCATC?GGAGA-5′，設計對應PCR引物是5′-TCATGAGCG?CATAGTT-3′和 5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′，本題（2）對產物測序，得到片段F的完整序列，因為片段F是被限制酶EcoRⅠ剪切的兩端，所以5′端應該是AATTC，對應F片段的開頭，故選B。

5 利用PCR技術快速檢測病原體

隨著PCR技術的改進，新冠病毒的核酸片段是通過實時熒光PCR的檢測的。那么，熒光定量PCR的原理究竟是什么？下面結合例題進行分析。

【例5】新型冠狀病毒是一種單鏈RNA病毒，新型冠狀病毒感染的常規檢測方法是通過實時熒光PCR鑒定，請回答以下問題。

（1）首先，從樣本中提取病毒RNA，經____酶作用生成cDNA。然后以cDNA為模板進行實時熒光PCR擴增，測定樣品中病毒核酸量。

（2）通過實時熒光PCR擴增目的基因，需額外添加熒光標記探針（一小段單鏈DNA，可與目的基因中部分序列特異性結合）。當探針完整時，不產生熒光。在PCR過程中，與目的基因結合的探針被TaqD?NA聚合酶水解，R與Q分離后，R發出的熒光可被檢測到（圖6A）。

圖6 實時熒光PCR

①當樣本中有目的基因時，引物和探針與目的基因退火，通過形成_________而特異性結合。

②在PCR循環的________階段，TaqDNA聚合酶催化子鏈的合成并水解探針。檢測到的熒光強度與反應體系中DNA分子數呈_______關系。

（3）在通過實時熒光PCR檢測新型冠狀病毒感染時，檢測到的熒光強度變化如圖6B所示。

①與指數增長期相比，線性增長期目的基因數量的增長率下降，原因有______________。

②Ct值的含義：在PCR擴增過程中，每個反應管內的熒光信號達到設定的熒光閾值時所經歷的擴增循環數。因此，當樣本中初始模板越多時，Ct值就__。

③某新型冠狀病毒核酸檢測說明書標明，Ct≤37判定為陽性，Ct＞40或無Ct值判定為陰性。圖6B所示新型冠狀病毒核酸檢測結果應判定為____________。

（4）陰性結果也不能排除新型冠狀病毒感染。可能產生假陰性的因素有______________（列舉2例）。

參考答案：（1）逆轉錄 （2）氫鍵 延伸 正比例 （3）底物濃度下降、酶活性下降 越小 陽性（4）①取樣太早，樣本中病毒量少，達不到實時熒光PCR檢測閾值 ②樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解 ③病毒發生變異

難點分析：傳統PCR進行檢測時，擴增后的產物需要進行染色和電泳分離，并且只能作定性分析，應用受到限制。實時熒光PCR是指在反應體系中加入熒光基團，通過對擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法（圖6）。其基本原理是：在PCR擴增時，除加入引物外，同時加入特異性的熒光探針，探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。擴增前，探針結合在DNA單鏈上，因報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，故檢測不到熒光信號；擴增時，TaqDNA酶將探針降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而使熒光監測系統接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物定量關系。