全自動烷基汞測定儀分析魚及魚飼料中的甲基汞

易華娟，蘇雍倫，何潔玲，張樹權，陳錦杭

（1.東莞市食品藥品檢驗所，廣東 東莞 523808；2.廣東醫科大學，廣東 東莞 523808；3.中山海關技術中心，廣東 中山 528403）

汞（Hg）是一種常見的高毒性元素，具有持久性、全球性和生物累積性[1]，主要分為無機態（Hg，Hg2+，Hg+）和有機態（MeHg、乙基汞（EtHg）等）[2]，有機汞的毒性較無機汞更強，其中MeHg的毒性最強[3]。Hg主要以氣態形式存在于大氣中，其中的無機汞因重力、雨水等原因進入地表[4]，同時水體因各種生產活動而被Hg污染，水中的無機汞經過微生物作用轉換為MeHg[5-6]。MeHg因其碳鏈短、分子量小、脂溶性大而極易被魚類吸收，而MeHg排除的速率卻很低，并因生物累積效應在生物體內富集，富集因子高達1×104～1×107[2]。所以，即使在低濃度MeHg的水里，還是能夠引起魚類的高水平污染，這最終都會反饋給食用者[7]。魚飼料在生產及儲存過程中會因復雜的環境、原材料及生產器械等而被甲基汞污染[8]。

研究指出，人類暴露于MeHg的主要途徑為食用水產品[7-9]，甲基汞沿著食物鏈中的細菌、浮游生物等富集到魚類中，被人類食用后，會被人體吸收并隨血液輸送到全身組織器官中[10]。中毒表現主要為末梢感覺紊亂、精神失常、喪失意識、震顫、共濟失調和向心性失調等[11]。上世紀50年代，日本“水俁事件”的成因就是食物鏈被MeHg污染[12]。因此，研究食物鏈中MeHg的累積效應對保護人類健康具有重要意義。

我國是世界水產養殖第一大國，同時也是汞污染較為嚴重的國家[13-14]，隨著養殖業的商業化，魚飼料在投料中所占比例也越來越高，魚飼料的污染水平將是控制水產品品質的關鍵[15]。目前，國內外對水生食物鏈中甲基汞的放大作用主要集中在不同營養層間的捕食關系上[16]，鮮有研究魚飼料在食物鏈中的累積效應。通過對不同魚體、飼料的深入分析，能夠使人們對甲基汞在不同魚體中的分布狀況有一定的認識，同時也為后續對于魚飼料中甲基汞的研究提供借鑒。

目前，液相和氣相色譜等分離方法與原子熒光光譜[17-18]、原子吸收光譜、原子發射光譜[19]和電感耦合等離子質譜[20-22]等高靈敏度的檢測儀器聯用被廣泛應用于甲基汞的檢測研究中[23]。但這些方法因成本高、前處理繁雜、耗時長、分析效果不理想等原因，限制了其在日常批量檢驗中的使用。研究采用了吹掃捕集-氣相色譜-冷原子熒光光譜儀法，該方法具有操作簡便、檢出限低、分離效果佳、時間短和成本低等優勢[24-25]。隨著檢測行業的發展和國家標準的完善，GC-CVAFS法在日常檢測中的推廣必定更具發展前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯇魚、草魚、烏鱧、鯉魚、鳙魚、多春魚、帶魚、鲅魚、黃花魚、鮸魚和魚飼料，購自市場。

氫氧化鉀、三水合乙酸鈉（優級純）、冰乙酸（色譜純），中國天津市科密歐化學試劑有限公司提供；鹽酸（優級純）、硝酸（分析純），廣州試劑廠提供；甲醇（色譜純），德國默克公司提供；四乙基硼化鈉（≥98%）；魚肉中總汞與甲基汞成分分析標準物質（標準值5.5±0.17 mg/kg），歐盟聯合研究中心提供；甲基汞標準溶液（1.0 mg/L），中國計量科學研究院提供。

1.2 儀器與設備

全自動甲基汞測定分析儀，美國Brooks Rand Labs公司產品；渦旋振蕩儀，德國IKA公司產品；烘箱，德國Memment公司產品；電子分析天平，北京Satorious科學儀器公司產品；微量移液器，德國艾本德有限公司產品；超純水處理系統，美國密理博產品。

1.3 試劑及標準溶液配制

1.3.1 20%（W/V）氫氧化鉀（KOH）甲醇溶液

稱取10.0 g KOH置于50 mL離心管中，分4次加入40 mL甲醇溶解，混勻，裝聚四氟乙烯試劑瓶內保存。

1.3.2 乙酸鈉（NaAc-HAc）緩沖溶液（2 mol/L）

稱取54.4 g三水合乙酸鈉，加入到23.6 mL冰乙酸中，用水定容至200 mL。

1.3.3 30%硝酸溶液

量取30 mL硝酸，加入至70 mL水中；2%（W/V）KOH水溶液：稱取1.0 g KOH置于50 mL塑料容量瓶中，加水溶解并定容至50 mL。

1.3.4 乙基化試劑

將質量分數為2%的KOH溶液置于-20℃冰箱中凍至水溶液出現晶體后，加入0.5 g四乙基硼化鈉粉末，混勻后分裝到液相小瓶中，置于-20℃下保存。

1.3.5 0.5%乙酸+0.2%鹽酸混合溶液

量取0.5 mL乙酸溶液和0.2 mL鹽酸溶液，緩緩倒入100 mL水中。

甲基汞標準使用液（200 pg/mL)：吸取相應量的甲基汞標準溶液，用0.5%乙酸+0.2%鹽酸混合溶液逐級稀釋至質量濃度為200 pg/mL，置于4℃以下冰箱儲存使用。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取前準備

將魚樣用水洗凈，取可食部分放入攪拌器中絞碎、混勻，裝入樣品罐中，放入-20℃冰箱中保存備用；取顆粒狀魚飼料放入攪拌器中絞碎至粉末狀、混勻，裝入樣品罐中保存備用。

1.4.2 堿法提取

稱取0.1 g（精確到0.000 1 g）樣品到50 mL離心管中，加入預先配制的質量分數為20%的KOH甲醇溶液5 mL，搖勻后置于60℃的烘箱中消解4 h。消解過程中，每隔1 h渦旋1次，使消解液與樣品充分接觸。在進樣瓶中加水至瓶頸處，加入樣品消解液50 μL，用10% HCl試劑調節pH值至6～8，加入NaAc-HAc緩 沖溶液300 μL，將pH值調節至4.5～5.0，加入乙基化試劑50 μL，加水至出現凸液面，迅速蓋上瓶蓋，搖勻，使其乙基化反應充分進行。

1.4.3 酸法提取

稱取0.1 g（精確到0.000 1 g）樣品到50 mL離心管中，加入質量分數為30%的硝酸溶液10 mL，蓋緊，置于60℃烘箱中消解12 h。取出消解完的樣品，加水定容至20 mL。在進樣瓶中加水至瓶頸處，準確移取0.2 mL樣品消解液至瓶內，再加入質量分數為20%的KOH甲醇溶液0.16 mL，用質量分數為10%的HCl溶液試劑調節pH值至6～8，加入NaAc-HAc緩沖溶液將pH值調節至4.5～5.0，加入50 μL的乙基化試劑，加水至出現凸液面，迅速蓋上瓶蓋，搖勻，使其乙基化反應充分進行。

1.5 標準曲線的配制

將40 mL棕色進樣瓶加水至瓶頸處，分別移取0.2 ng/mL甲基汞標準溶液0.05，0.25，0.50，1.25，2.50，5.00 mL，加入NaAc-HAc緩沖溶液300 μL，再加入乙基化試劑50 μL，加水至呈凸液面，蓋緊混勻，配成甲基汞質量分別為10，50，100，250，500，1 000 pg的標準溶液系列。

1.6 儀器條件及原理

1.6.1 儀器條件

冷原子熒光檢測器光電倍增管（PMT）電壓670 V；基線信號值36 μV；吹掃捕集氣：氮氣，流速50 mL/min，時間5 min；干燥氣：氮氣，流速40 mL/min，時間3 min；Tenax管解析加熱時間9.9 s；GC溫度35℃；GC載氣為氬氣，流速30 mL/min。

1.6.2 儀器工作原理

全自動烷基汞測定分析儀的儀器檢出限（IDL）為0.002 ng/L，其工作原理為：將樣品經前處理消解提取出甲基汞，取定量樣液進行乙基化反應后，在加壓狀態下被氮氣自動輸送至氣液分離器中，經氮氣吹脫至Tenax捕集管并被干燥，加熱Tenax捕集管使Hg解析，而后被氬氣輸送至氣相柱使不同形態的Hg分離，熱解還原為單質Hg，經冷原子熒光檢測器（CVAFS）進行測定[26]。

陽性樣品出峰色譜圖見圖1。

圖1 陽性樣品出峰色譜圖

色譜圖中包含3個峰，從左到右依次為Hg0，MeHg，Hg2+和CH3-CH2-Hg+。

2 結果與分析

2.1 GC柱分離溫度的優化

取衍生好的甲基汞標準溶液作為樣品，設定GC溫度為30，35，40，45℃，比較不同溫度下Hg0，MeHg，Hg2+和CH3-CH2-Hg+乙基化產物的分離效果。由圖1可知，溫度為45℃時，3個峰勉強分離；當溫度為30，35，40℃時，3個峰可以完全分離開；但溫度為30℃時，MeHg的峰拖尾時間較長，不利于快速檢測；所以，當溫度為35℃和40℃時，3個峰的分離效果最好，考慮到經濟效益及環保節能，選取35℃作為GC柱的分離溫度最為合適。

2.2 乙基化反應條件的優化

2.2.1 乙基化反應的pH值

用標準參考物質作為質控樣品，按照1.4.2中堿法消解的步驟對樣品進行前處理，用質量分數為10%的HCl溶液試劑調節pH值至6～8后，加入濃度為2 mol/L的NaAc-HAc緩沖溶液調節pH值至3，4，5，6，8，9，10，每個pH值條件做6組平行。

乙基化反應pH值對回收率的影響（n=6）見圖2。

圖2 乙基化反應pH值對回收率的影響(n=6)

回收率在pH值5時最高，此時添加的2 mol/L NaAc-HAc緩沖溶液為300 μL，回收率為99.927%。研究所得的最佳乙基化反應pH值與王雪婷等人[27]的研究結果相符。

2.2.2 乙基化試劑的使用量

乙基化試劑的使用量對乙基化反應有直接影響，乙基化試劑使用量過少時甲基汞的乙基化反應不充分，但使用量過大時又會使得乙基化反應劇烈造成甲基汞揮發而損失，回收率下降，同時也會提高試驗成本[28]。因此，確定最佳的乙基化試劑使用量尤為重要。

用標準參考物質作為質控樣品，按照1.4.2中堿法消解的步驟對樣品進行前處理，分別加入乙基化試劑20，40，50，70 μL，測定其含量。

不同乙基化試劑使用量時標樣中MeHg的測定值（n=6）見表1。

表1 不同乙基化試劑使用量時標樣中MeHg的測定值（n=6）

由表1可知，乙基化試劑的投加量為40 μL和50 μL時，標樣的測定值都在標準值范圍內，為確保樣品中的乙基化反應充分進行，試驗選取的乙基化試劑投加量為50 μL。

2.3 消解方法的比較

在生物組織中，有機汞的含量占總汞的70%～90%，有機汞化合物與硫基高度親和[29]，必須通過化學試劑破壞硫化合物，從而釋放有機汞。不同的提取方式對MeHg的回收率和不同形態Hg之間的轉換會產生不同的效果。因此，樣品的前處理方法對于檢測結果中的質量控制至關重要。

2.3.1 魚肉消解方法的選擇

稱取魚肉中甲基汞成分分析標準物質作進行試驗，分別按照1.4中的酸法和堿法對樣品進行消解。

2種消解方法處理魚肉標準物質的結果對比（n=3）見表2。

表2 2種消解方法處理魚肉標準物質的結果對比（n=3）

由表2可知，2種方法的回收率相差不大，測定值均在標準值范圍內，因此2種前處理方法均適用于魚類中甲基汞的測定。考慮到堿法消解的前處理時間相較于酸法消解短，接下來魚類中甲基汞的測定均采用堿法消解。

2.3.2 魚飼料消解方法的選擇

分別按照1.4中的堿法和酸法對樣品進行前處理。

2種消解方法處理魚飼料的結果對比（n=6）見表3。

表3 2種消解方法處理魚飼料的結果對比（n=6）

魚飼料的基質較為復雜，富含蛋白質原料，如魚粉、蝦粉、豆粕和米糠等。魚飼料消解完成后，發現酸法的消解液沉淀少、呈澄清狀態，而堿法處理魚飼料樣品的消解液中出現乳濁、顆粒性沉淀現象及少量泡沫。酸法消解的RSD%為2.92%，具有良好的平行性；堿法消解的RSD%為9.81%，且提取效率顯著低于酸法消解（p＜0.05）。

由消解現象及測定結果可知，相比于堿法消解，酸法消解能較完全地消解魚飼料樣品并提取甲基汞，因此接下來的試驗中魚飼料采取酸法消解。

2.4 線性關系

質量分別為10，50，100，250，500，1 000 pg的一系列標準溶液，在上述優化條件下測定，以MeHg的出峰高度為縱坐標（Y），MeHg質量為橫坐標（X），作線性回歸曲線，標準曲線方程為Y=365.68X-1 900.2，相關系數R2=0.999 8。

2.5 方法檢出限與定量限

以11個空白樣品考查該方法的靈敏度，計算11個空白樣品測量值的標準偏差，以3倍標準偏差為檢出限，10倍標準偏差為定量限。根據樣品前處理方法中的稱樣量和稀釋倍數，可計算出方法的檢出限和定量限。

不同消解方法的檢出限和定量限見表4。

表4 不同消解方法的檢出限和定量限

2.6 方法精密度與準確度

分別選取草魚和魚飼料作為試驗材料，以1倍，2倍及10倍定量限作為加標水平。分別按照1.4中的堿法和酸法對樣品進行消解及測定。每個加標水平做6個平行試驗。

魚肉中甲基汞加標回收率和精密度測定結果（n=6）見表5，魚飼料甲基汞加標回收率和精密度（n=6）見表6。

表5 魚肉中甲基汞加標回收率和精密度測定結果（n=6）

表6 魚飼料甲基汞加標回收率和精密度（n=6）

在低、中、高3個加標水平下的回收率和RSD均符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中附錄F的要求，定量限適用性良好。

2.7 實際樣品的測定

應用研究建立的分析方法對10種魚類和10批魚飼料進行測定。

魚及魚飼料中甲基汞含量的測定結果（n=6）見表7。

由表7可知，淡水魚測定含量為3.79～16.74 μg/kg，海水魚測定含量為26.45～142.19 μg/kg。魚飼料中2批檢出甲基汞的含量范圍為3.68 μg/kg和5.51 μg/kg。GB 2762—2017《食品中污染物限量》中MeHg限量規定：肉食性水產動物及其制品1.0 mg/kg，非肉食性魚類及其制品0.5 mg/kg，在此次測定中所有水產品的MeHg含量均符合該限量要求。

表7 魚及魚飼料中甲基汞含量的測定結果（n=6）

從結果大致可知，海水魚的甲基汞含量普遍高于淡水魚中的甲基汞含量，造成這種差異的原因可能是生活環境和食物中甲基汞濃度的不同。海水魚多數是野生的且生長周期長，在海水中有較長且穩定的食物鏈，對于甲基汞的富集作用強。而淡水魚一般是養殖魚，淡水中的甲基汞污染沒有海水中的污染嚴重，且能夠人為控制，并且主要以甲基汞含量極低的魚飼料作為主要食物來源，生長周期短，食物鏈短，富集MeHg的程度低[30]。

3 結論

建立了氣相色譜-冷蒸氣原子熒光光譜法測定魚及魚飼料中甲基汞的方法，該方法靈敏度高，操作步驟簡便快速、準確、高效、經濟可行，分析測定得到的數據具有良好的精密度，準確性高，在日常檢測中具有很大的推廣空間和發展前景。