綠色前體合成的碳量子點(diǎn)熒光猝滅法快速檢測(cè)藥物中痕量鐵離子

喻文湛，李倩，廖微，任靜，肖錫林，廖力夫，薛金花

(1.南華大學(xué) 藥學(xué)院， 湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院， 湖南 衡陽(yáng) 421001； 3.南華大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽(yáng) 421001)

碳量子點(diǎn)(CQDs，carbon quantum dots)具有獨(dú)特的光致發(fā)光性質(zhì)、高穩(wěn)定性、良好的親水性和生物相容性、低毒性等，在光電催化、生物成像、藥物載體、離子及藥物檢測(cè)等領(lǐng)域有很大的應(yīng)用前景[1-7]，其中不乏用于Fe3+檢測(cè)的研究[8-14]。目前CQDs制備方法主要有水熱法、微波法、模板法和電化學(xué)法等[15-16]，水熱法是實(shí)驗(yàn)室常用方法之一。研究者用來制備CQDs的前體除檸檬酸、乙二胺等[17-18]一些有機(jī)試劑外也包括明膠[19]、橙汁[20]、梨汁[21]、蔗糖[22]、蜂蜜[23]和橙皮等[24]天然物質(zhì)。本研究即用自然環(huán)境中的樟樹葉作為前體通過水熱法一步合成了CQDs，并用其建立了檢測(cè)Fe3+的熒光法，用于補(bǔ)鐵藥中鐵含量的分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

KH2PO4、Na2HPO4、Fe(NO3)3·9H2O等均為分析純，且未經(jīng)純化處理；實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

UV-3900型紫外-可見分光光度計(jì)；F-7000型熒光光譜儀；IRPrestige-21型紅外光譜儀；PHS-3E型pH計(jì)。

1.2 試劑配制

1.2.1 0.1 mol/L PBS緩沖液的配制 稱取1.360 9 g KH2PO4，用超純水溶解，于100 mL容量瓶定容得甲液；稱取1.419 6 g Na2HPO4，用超純水溶解，于100 mL容量瓶定容得乙液；將甲液與乙液以不同比例混合，經(jīng)pH計(jì)調(diào)至不同pH得一系列pH的PBS緩沖液。

1.2.2 0.01 mol/L Fe3+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制 稱取0.404 g Fe(NO3)3·9H2O，用超純水溶解，于100 mL 容量瓶定容得0.01 mol/L Fe3+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3 CQDs的制備

將采摘得的新鮮樟樹葉洗凈、烘干，研磨成粉后過200目篩，將過篩粉末收集。稱取樟樹葉粉末1 g，量取50 mL超純水加入，邊超聲邊攪拌充分混勻后將溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯反應(yīng)釜中，于200 ℃下反應(yīng)5 h，冷卻至室溫，將產(chǎn)物離心取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，收集濾液于4 ℃冰箱避光保存。

1.4 實(shí)際樣品的處理

采集來自不同廠家的同種補(bǔ)鐵藥。分別取2片藥研成粉末狀，濃硫酸溶解，直至粉末完全碳化成黑色，然后邊加熱邊滴加體積比為3∶1的硝酸和雙氧水的混合溶液，直至黃煙消失，溶液變澄清透明。待溶液冷卻后，離心分離除去無法消解的白色固體，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用超純水洗滌殘?jiān)瑢⑾礈煲阂徊⑥D(zhuǎn)入容量瓶，超純水定容，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 CQDs的紅外表征

圖1 碳量子點(diǎn)的紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectrum of CQDs

2.2 CQDs的光學(xué)性質(zhì)

CQDs表現(xiàn)出明顯的熒光強(qiáng)度和發(fā)射位置依賴激發(fā)波長(zhǎng)的性質(zhì)(圖2)，其在不同激發(fā)波長(zhǎng)(320～420 nm，每次間隔10 nm)下，隨著激發(fā)波長(zhǎng)增大，發(fā)射峰逐漸紅移，從418 nm紅移到498 nm，同時(shí)，發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸減弱，320 nm熒光強(qiáng)度最大，為最佳激發(fā)波長(zhǎng)。圖3為制得的CQDs的紫外吸收光譜及熒光光譜。

圖2 碳量子點(diǎn)在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的發(fā)射光譜Fig.2 Emission spectra of CQDs at different excitation wavelengths

圖3 碳量子點(diǎn)的紫外吸收和熒光光譜圖Fig.3 UV-Vis absorption and fluorescence spectra of CQDs a.紫外吸收光譜；b.激發(fā)光譜；c.發(fā)射光譜

2.3 條件優(yōu)化

2.3.1 pH的優(yōu)化 在不同pH條件下，F(xiàn)e3+對(duì)CQDs的熒光猝滅程度不同。見圖4，當(dāng)體系的pH為7.5時(shí)，|ΔF| 最大，即Fe3+對(duì)CQDs的熒光猝滅程度最大，因此該反應(yīng)最佳pH取7.5，后續(xù)實(shí)驗(yàn)的pH條件為7.5。

圖4 pH的優(yōu)化Fig.4 Optimization of pH

2.3.2 CQDs用量的優(yōu)化 固定Fe3+濃度為1×10-4mol/L，改變CQDs用量，研究熒光猝滅情況。見圖5，隨著CQDs用量增加，熒光猝滅程度增大，用量達(dá)到120 μL后趨于穩(wěn)定，因此，以120 μL作為CQDs的最佳用量。

圖5 CQDs用量的優(yōu)化Fig.5 Optimization of the volume of CQDs

2.3.3 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化 加入0.01 mol/L Fe3+100 μL后CQDs溶液的熒光猝滅程度隨時(shí)間的變化見圖6，隨著時(shí)間的推移，CQDs溶液的熒光強(qiáng)度逐漸減小后趨于穩(wěn)定，|ΔF| 逐漸增大后趨于穩(wěn)定，到10 min時(shí)基本穩(wěn)定，反應(yīng)迅速，后續(xù)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間確定為10 min。

圖6 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化Fig.6 Optimization of the reaction time

2.4 Fe3+檢測(cè)

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限 在適量緩沖液中加入120 μL CQDs溶液，而后分別加入不同量Fe3+標(biāo)準(zhǔn)工作液，用緩沖液定容至10 mL，室溫下反應(yīng)10 min后，在λEx=320 nm下測(cè)定熒光發(fā)射峰強(qiáng)度，從圖中可以看到，隨著Fe3+濃度的增大，CQDs的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。以F/F0對(duì)Fe3+濃度做線性擬合(F0和F分別對(duì)應(yīng)不加Fe3+及加入不同濃度Fe3+的CQDs熒光發(fā)射峰強(qiáng)度)，F(xiàn)/F0與Fe3+濃度在2.72×10-5～1.00×10-4mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為F/F0=0.973 5-0.033 2c(×10-5mol/L)， 相關(guān)系數(shù)R2=0.991 2。根據(jù)LOD=3Sb/k計(jì)算得到檢出限為8.16 μmol/L，Sb和k分別表示空白溶液的標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

圖7 碳量子點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線熒光圖譜Fig.7 Standard curve fluorescence spectrum of CQDs

2.4.2 CQDs的選擇性實(shí)驗(yàn) 在適量緩沖液中加入120 μL CQDs溶液，然后分別將100 μL 0.01 mol/L 的Li+、Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Al3+、Ca2+、Ba2+、Cu2+、Fe3+、Fe2+溶液加入，緩沖液定容到10 mL，混合均勻后在320 nm激發(fā)波長(zhǎng)下測(cè)定其熒光強(qiáng)度。見圖8a，加入Fe2+后CQDs溶液的熒光猝滅程度與加入Fe3+后的相近，而Fe2+(H+)為pH 5.5條件下加入Fe2+后CQDs溶液的熒光猝滅程度，與前面pH 7.5時(shí)相差甚遠(yuǎn)，可能原因?yàn)椋涸趬A性條件下，F(xiàn)e2+更快被氧化為Fe3+，從而使CQDs熒光被猝滅。所以，F(xiàn)e2+本身其實(shí)并不能猝滅CQDs的熒光。而且二價(jià)鐵是難以穩(wěn)定存在的，且對(duì)補(bǔ)鐵藥中的鐵含量進(jìn)行檢測(cè)前需將藥片進(jìn)行前處理，使藥片中的二價(jià)鐵全部轉(zhuǎn)化為三價(jià)鐵。見圖8b，將5倍量Fe3+的其他離子溶液和1倍量的Fe3+溶液分別加入到制備的CQDs溶液中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在濃度5倍于Fe3+的情況下，其他金屬離子對(duì)CQDs熒光強(qiáng)度影響不大，因此CQDs對(duì)Fe3+具有較好的選擇性。

圖8 碳量子點(diǎn)對(duì)金屬離子的選擇性Fig.8 Selectivity of CQDs for metal ions a.c(其他離子)=c(Fe3+)；b.c(其他離子)=5c(Fe3+)

2.4.3 實(shí)際補(bǔ)鐵藥中鐵含量的測(cè)定 為評(píng)價(jià)本方法的可靠性，以來自不同廠家的同種補(bǔ)鐵藥為測(cè)試對(duì)象，測(cè)試結(jié)果見表1。樣品1和2分別為來自不同廠家的同一種補(bǔ)鐵藥，對(duì)其進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(n=6)，測(cè)得加標(biāo)回收率為93.08%～105.05%。

表1 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 1 Results of recovery test (n=6)

3 結(jié)論

本研究以自然界中的樟樹葉作為前體，通過一步水熱法合成了CQDs，還將制得的CQDs用于Fe3+檢測(cè)。在320 nm激發(fā)波長(zhǎng)下，加入Fe3+反應(yīng)后CQDs溶液的熒光強(qiáng)度與未加Fe3+的CQDs溶液的熒光強(qiáng)度比F/F0與Fe3+濃度在2.72×10-5～1.00×10-4mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(R2=0.991 2)，回歸方程為F/F0=0.973 5-0.033 2c(×10-5mol/L)，檢出限為8.16 μmol/L。將其應(yīng)用于補(bǔ)鐵藥中鐵含量的測(cè)定時(shí)，加標(biāo)回收率為93.08%～105.05%，結(jié)果良好。本研究中制備碳量子點(diǎn)的方法簡(jiǎn)便快速，原料環(huán)保易得，用于Fe3+檢測(cè)線性良好，靈敏度較高，選擇性較好，用于補(bǔ)鐵藥中鐵含量的檢測(cè)結(jié)果也令人滿意。