丙泊酚和七氟醚麻醉對老年大鼠腹部術后認知功能的影響

范曉英 鄭仲磊 張萬平 薛沙

術后認知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction，POCD)是全身麻醉后影響中樞神經系統功能的最常見的并發癥之一，多發于老年人[1]。合理的麻醉方案有助于保護患者的中樞神經系統損害。涉及女性子宮附件及胃腸、肝膽和膀胱的手術均需要開腹，而麻醉和手術與患者POCD的發生密切相關。丙泊酚和七氟醚均是臨床十分常用的麻醉維持藥物，有研究報道，丙泊酚麻醉在腦部手術患者中具有較好的神經保護作用[2]。腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)是一種廣泛表達于中樞神經系統的神經營養因子，其在神經元存活和分化以及突觸可塑性中發揮關鍵作用[3]。BDNF的失調導致與創傷性腦損傷、腦缺血、神經退行性疾病及POCD密切相關[4,5]。本研究擬通過觀察丙泊酚、七氟醚麻醉的腹部手術大鼠認知功能，檢測海馬炎性反應和氧化應激反應及BDNF的表達，揭示丙泊酚在老年患者腹部手術麻醉中減少認知功能損害的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只18月齡健康的清潔級SD大鼠(537±55)g購自上海斯萊克實驗動物公司，合格證號：SCXK(滬)2021-0014。實驗前1周進行(23±1)℃，(55±5)%濕度的環境下足料足水，常規晝夜飼養。

1.2 試劑與儀器 丙泊酚乳狀注射液(國藥準字：H20010368)購自西安力邦制藥；七氟醚(國藥準字號：H20080681)購自魯南貝特制藥；戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司；人白介素1β(IL-1β)檢測試劑盒、白介素6(IL-6)檢測試劑盒、腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒均購自上海碧云天；兔抗BDNF多克隆抗體(28205-1-AP)、兔抗β-actin單克隆抗體(4970)、HRP標記的山羊抗兔二抗均購自美國Cell Signaling Technology；實驗動物用氣體麻醉機購自美國EZSystems；IQ-1000 多功能氣體檢測儀購自美國IST；YH-MWM Morris水迷宮實驗系統購自武漢一鴻科技公司；XR-XZ301型曠場實驗視頻分析系統購自上海欣軟信息科技公司。Spark多功能酶標儀購自上海帝肯貿易公司；ChemiDocXRS+凝膠成像系統購自美國Bio-rad。

1.3 麻醉與分組 40只大鼠隨機分為丙泊酚組、七氟醚組，每組20只。

1.3.1 丙泊酚組：大鼠進行腹腔注射丙泊酚100 mg/kg麻醉，行開腹手術，關閉腹腔。

1.3.2 七氟醚麻醉需要帶有鈉石灰的密閉透明麻醉箱，進氣孔與實驗動物用氣體麻醉機連接，出氣孔與氣體監測儀連接，監測七氟醚的濃度。

1.3.3 處理：待大鼠自由蘇醒，可行走1 d。從2組大鼠中各選4只，注射戊巴比妥麻醉，斷頸法處死大鼠，無菌分離海馬，-80℃保存，備用。

1.4 Morris水迷宮實驗[6]大鼠在進行麻醉前每天進行學習訓練，連續5 d，4次/d，每次間隔20 min。第6天對大鼠進行麻醉手術。待大鼠蘇醒且可行走后1 d，進行逃避潛伏期、游泳距離測試。連續5 d，4次/d，每次間隔20 min。通過水迷宮視頻跟蹤分析系統記錄大鼠1 min內找到水下平臺的時間(逃避潛伏期)及游泳路線距離(cm)，以進行評估。

1.5 曠場實驗 剩余8只大鼠，放在準備好的礦場分析箱中央格內，大鼠自由活動5 min。通過圖像跟蹤監視系統記錄大鼠的路程、理毛次數、站立次數(離地>1 cm)和跨格次數(3個肢體跨入)。每次結束后，避免氣味殘留，需乙醇擦拭。

1.6 酶聯免疫吸附實驗 取部分大鼠海馬組織，加入2倍體積的雙蒸水，無菌研磨。分裝置2 ml的EP管，離心，取上清進行炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)，氧化應激因子(MDA、SOD)的含量檢測。具體檢測的操作步驟嚴格按照試劑盒的說明書操作，判定標準確定樣本中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、SOD的含量。

1.7 蛋白免疫印跡實驗 無菌研磨大鼠海馬組織，加入3倍體積的RIPA裂解液，冰上充分裂解。提取組織總蛋白，測定蛋白濃度并變性。將變性蛋白上樣行SDS-PAGE電泳，再將蛋白濕轉至PVDF膜。用含有2.5%脫脂奶粉的封閉液37℃孵育2 h。充分洗膜3次，浸入稀釋過的一抗溶液(兔抗BDNF多克隆抗體，1∶1 000；兔抗β-actin單克隆抗體，1∶2 000)，4℃孵育過夜。同樣洗膜，浸入稀釋過的二抗溶液(HRP標記的山羊抗兔二抗，1∶500)，37℃孵育2 h。洗膜后用ECL發光液顯影曝光。Image J軟件分析蛋白灰度，用目的蛋白的灰度值與內參β-actin的灰度值之比表達蛋白的相對表達。

2 結果

2.1 2組大鼠Morris水迷宮實驗結果比較 丙泊酚組、七氟醚組大鼠剖腹術前第1、3、5天的逃避潛伏期和游泳距離差異無統計學意義，術后丙泊酚組大鼠第1、3、5天的逃避潛伏期和游泳距離均顯著低于七氟醚組(P<0.05)。見表1、2。

表1 2組腹部手術大鼠逃避潛伏期比較

表2 2組對腹部手術大鼠游泳距離比較

2.2 2組腹部手術大鼠礦場實驗比較 2組大鼠術后第1天的理毛、站立、跨格的次數差異無統計學意義，第5天的理毛、站立、跨格的次數丙泊酚組顯著高于七氟醚組(P<0.05)。見表3。

表3 2組對腹部手術大鼠礦場實驗比較 n=20，次,

2.3 2組對腹部手術大鼠海馬炎性反應比較 丙泊酚組IL-1β、IL-6、TNFα、MDA含量均顯著低于七氟醚組，SOD的含量顯著高于七氟醚組(P<0.05)。見表4。

表4 丙泊酚、七氟醚對腹部手術大鼠海馬炎性因子IL-1β、IL-6、TNFα、MDA、SOD含量比較

2.4 2組對腹部手術大鼠海馬BDNF蛋白表達比較 丙泊酚組大鼠海馬中BDNF的蛋白表達量顯著高于七氟醚組(P<0.05)。見圖1，表5。

圖1 BDNF蛋白電泳圖

表5 2組腹部手術大鼠海馬BDNF蛋白相對表達量

3 討論

有學者認為，在一定情況下，麻醉藥可能對各種神經損傷具有保護作用，當然也有研究者認為麻醉藥可能具有神經毒性，如引起淀粉樣β的沉積[7,8]。不同的麻醉藥對大腦的影響及其在不同患者群體和臨床環境中的功能仍不確定，因此麻醉藥的選擇對患者認知功能的恢復非常重要。異丙酚可引起發育期大鼠的大腦神經元細胞的死亡，但對老年大鼠腦神經細胞具有保護作用[8]。Zhang等[9]研究發現，術后3個月異丙酚麻醉患者發生認知功能障礙的概率明顯低于七氟醚麻醉，術后第2天異丙酚麻醉患者的QoR-40總體評分顯著高于七氟醚麻醉[10]。劉蕊池[11]在探究丙泊酚與七氟醚麻醉對顱腦損傷患者術后認知功能的研究中報道，丙泊酚麻醉的患者血清腦損傷標志物、應激指標和MMSE評分均顯著低于七氟醚麻醉患者。Tang等[12]研究發現異丙酚可有效改善術后認知功能并降低不良反應的風險。

在一項關于接受腹腔鏡膽囊切除術老年患者的麻醉藥比較的研究中顯示，相較于七氟醚或異氟醚麻醉，接受異丙酚麻醉的患者在術后第1天和第3天發生認知功能障礙者顯著降低，血漿中S-100β和Aβ1-40蛋白及IL-1β、IL-6和TNF-α濃度均顯著降低，說明了異丙酚在老年患者腹腔手術麻醉中有很大優勢[13]。本研究發現，丙泊酚麻醉的大鼠逃避潛伏期和游泳距離明顯降低，大鼠的理毛、站立、跨格的頻率也明顯升高，充分說明了在進行腹部手術時丙泊酚麻醉優于七氟醚，同時丙泊酚麻醉的大鼠海馬IL-1β、IL-6、TNFα和MDA的濃度均顯著降低，SOD的濃度顯著升高，這也說明了丙泊酚麻醉能夠降低大鼠認知功能損傷的潛在機制。

BDNF是一種在神經可塑性中起重要作用的神經營養因子，其在術后認知功能障礙中也具有關鍵作用[14]。Xie等[15]在研究BDNF與術后患者認知功能障礙關系的研究中報道，在術后7 dBDNF rs6265位點攜帶G等位基因的患者發生認知功能障礙的風險低于A等位基因攜帶者，而在術后3個月則相反，揭示了BDNF rs6265多態性可能與術后7 d認知功能障礙的發生有關，rs6265位點的A>G突變可能是中國漢族人群早期認知功能障礙的保護因素。BDNF/TrkB信號通路的活性在術后老年小鼠體內受到抑制，并且這是小鼠術后發生認知功能障礙的重要機制[16]。為了探索麻醉藥丙泊酚和七氟醚對BDNF是否具有影響，本研究通過WB法檢測大鼠海馬中BDNF的蛋白表達發現，丙泊酚麻醉大鼠海馬中BDNF的蛋白表達顯著高于七氟醚麻醉大鼠海馬。此研究結果更說明丙泊酚麻醉對神經損傷的潛在保護作用，揭示了丙泊酚麻醉對臨床腹部手術的老年患者的意義。

總之，丙泊酚在老年大鼠腹部手術麻醉中可降低炎性和氧化應激反應，增強BDNF的神經保護作用，減輕認知功能的損害，值得臨床的老年人腹部手術中進行推廣。