AQP1、miR-3195、PINCH-1在喉癌中的表達及作用機制研究

陶維平 李琴 李湘勝

喉癌是發生于喉部的疾病，是臨床較常見的頭頸部惡性腫瘤，主要癥狀為聲嘶、咳嗽、吞咽及呼吸困難等[1,2]。流行病學調查顯示，我國喉癌的發病率有明顯的地域、性別差異，中老年人群患病率較高，且男性高于女性[3]。由于喉癌臨床早期階段無特異性癥狀，導致喉癌的早期診斷率較低，隨著病情的惡化，嚴重影響患者預后[4]。因此，及早診斷并治療對改善喉癌患者病情及預后具有重要價值。據有關調查顯示，喉癌與水通道蛋白1(AQP1)、微小RNA-3195(miR-3195)、PINCH-1表達存在相關性[5]。AQP1屬于水通道蛋白家族，在血管內皮表達廣泛，在腫瘤的生長、浸潤、侵襲中有重要作用；miR-3195屬于微小RNA家族，可調控細胞增殖、凋亡；PINCH-1屬于LIM家族，可參與信號轉導、調節細胞形態等生物學功能[6,7]。本研究對喉癌患者癌組織進行手術切除，對癌組織標本中AQP1、miR-3195、PINCH-1表達進行檢測，旨在探究其變化與喉癌病理特征之間的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年5月至2020年11月于我院進行手術治療的喉癌患者81例，男62例，女19例；年齡53.0～65.0歲，平均年齡(59.0±4.8)歲；其中癌組織分化程度：中低分化60例，高分化20例；腫瘤浸潤深度：T1～T2期54例，T3～T4期27例；TMN分期：Ⅰ～Ⅱ期43例，Ⅲ～Ⅳ期38例；淋巴結轉移情況：有轉移25例，無轉移56例。本研究獲得我院倫理委員會審批通過。

1.2 納入與排除標準 (1)納入標準：均符合喉癌診斷標準[8]，均為病理學首次確診，未接受過其他抗腫瘤治療，病歷資料齊全，所有患者對本研究知情并簽署同意書。(2)排除標準：患復發性喉癌者；喉癌癌前病變者；合并嚴重代謝類疾病者；有手術禁忌證者；合并其他惡性腫瘤者；合并嚴重感染性疾病者；患精神疾病者。

1.3 方法

1.3.1 標本采集、免疫組化染色：收取所有喉癌患者手術切除的癌組織、距離癌組織4 cm的癌旁組織制作組織標本，-45℃冰箱凍存待用。取凍存的癌組織、癌旁組織置于甲醛溶液中固定24 h，流水沖洗30 min，不同濃度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋。連續切4 μm 薄片，溫水燙平，置于載玻片上，恒溫箱烘干，二甲苯脫蠟，無水乙醇脫去二甲苯，乙醇脫水，蒸餾水清洗，枸櫞酸緩沖液浸泡修復15 min，PBS洗滌液清洗，加POD阻斷劑，37℃溫育30 min，PBS洗滌液清洗，加山羊血清，室溫培育30 min，加一抗，孵育過夜，PBS洗滌液清洗，加二抗，常溫孵育30 min，清洗，加DAB顯色劑，PBS洗滌液清洗，蘇木精復染5 min，自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s，氨水反藍，蒸餾水清洗，伊紅染色2 min，乙醇脫水，中性樹膠封片，光學顯微鏡(深圳市博視達光學儀器有限公司，型號：BD-F1A)下觀察。

1.3.2 熒光定量PCR檢測AQP1、miR-3195、PINCH-1表達：取凍存的喉癌組織及癌旁組織，剪刀滅菌后剪碎，置于勻漿器中，加RNAiso Plus溶液，水浴裂解至無顆粒透明狀，移入EP管，室溫靜置5 min，加氯仿，劇烈震蕩均勻，室溫靜置5 min，5℃高速離心10 min，將上層水相移入新EP管，加異丙醇，靜置，5℃高速離心5 min，棄上清液，室溫干燥，加DEPC，緩慢吹打至RNA沉淀，提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)獲得cRNA，Primer5.0軟件設計引物，PRC擴增條件：95℃ 3 min預變性，95℃ 30 s，60℃ 4min，75℃ 20 s，重復35個循環；75℃終末延伸5 min。2-△△Ct法計算AQP1、miR-3195、PINCH-1表達。

2 結果

2.1 喉癌患者癌組織、癌旁組織中AQP1、miR-3195、PINCH-1表達比較 喉癌患者癌組織中AQP1、PINCH-1表達高于癌旁組織，miR-3195表達低于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖1，2。

表1 癌組織、癌旁組織中AQP1、miR-3195、PINCH-1表達比較

圖1 癌旁組織中AQP1、miR-3195、PINCH-1表達(免疫組化染色)

圖2 癌組織中AQP1、miR-3195、PINCH-1表達(免疫組化染色)

2.2 不同病理特征患者AQP1、miR-3195、PINCH-1表達比較 中低分化程度患者AQP1、PINCH-1表達高于高分化程度患者，miR-3195表達低于高分化程度患者(P<0.05)；腫瘤浸潤深度為T1～T2期患者AQP1、PINCH-1表達低于T3～T4期患者，miR-3195表達高于T3～T4期患者(P<0.05)；TMN分期為Ⅰ～Ⅱ期患者AQP1、PINCH-1表達低于Ⅲ～Ⅳ患者，miR-3195表達高于Ⅲ～Ⅳ患者(P<0.05)，淋巴結轉移患者AQP1、PINCH-1表達高于淋巴結未轉移患者，miR-3195表達低于淋巴結未轉移患者，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同病理特征患者AQP1、miR-3195、PINCH-1表達比較

2.3 AQP1、miR-3195、PINCH-1單一及聯合檢測對喉癌的預測價值 與AQP1、miR-3195、PINCH-1單一檢測比較，AQP1、miR-3195、PINCH-1聯合檢測對喉癌的預測價值較高(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 AQP1、miR-3195、PINCH-1單一及聯合診斷喉癌的ROC曲線圖

表3 AQP1、miR-3195、PINCH-1單一及聯合檢測對喉癌的預測價值

2.4 AQP1、miR-3195、PINCH-1在喉癌中的相關性分析 使用Pearson對AQP1、miR-3195、PINCH-1在喉癌中相關性分析發現，AQP1、miR-3195呈負相關(r=-0.476；P=0.001)；AQP1、PINCH-1呈負相關(r=-0.645；P=0.001)；miR-3195、PINCH-1呈正相關(r=0.523；P=0.001)。見圖4。

圖4 喉癌癌組織中AQP1、miR-3195、PINCH-1表達相關性

3 討論

據相關調查顯示，喉癌在我國頭頸部惡性腫瘤中位列第二位，近年來發病率不斷升高，且有年輕化趨勢[9,10]。臨床主要治療手段有手術、化療、基因治療等，晚期治療效果不理想，因此，及早發現并治療用以提高患者預后具有重要價值[11,12]。

AQP1可介導水分子跨膜運動，在腫瘤的遷徙、血管形成中具有重要價值[13]。研究發現，中晚期喉癌患者中AQP1、斯鈣素-1(SCT-1)表達較高，且分化程度、腫瘤分期等于AQP1、SCT-1表達密切相關[14]，與本文研究結果一致。喉癌患者癌組織中AQP1表達較高，且隨著腫瘤惡化程度增加而上升，可能是AQP1可增加腫瘤血管的通透性，促使水在腫瘤細胞間轉運加速，加速腫瘤血管生成，從而加速腫瘤惡化[15]。本研究顯示，AQP1可能參與喉癌的發生發展。本文研究還發現，AQP1表達與癌組織分化程度、腫瘤浸潤深度、TMN分期、淋巴結轉移情況等密切相關，可參與喉癌的發生演進過程。

miR-3195位于20號染色體q13.33，與造血系統腫瘤密切關系，可調控細胞的生長、侵襲等[16]。有研究結果發現，喉癌患者癌組織中miR-3195表達降低，可能與miR-3195可靶向調控ST3GAL2的表達，參與喉癌的發生發展相關[17]。大量研究顯示，miR-3195可通過TBX1靶向抑制喉癌細胞Hep-2的增殖，miR-3195低表達導致抑制喉癌細胞Hep-2的增殖減弱，miR-3195有作為喉癌潛在的治療靶點[18]。本研究顯示，喉癌癌組織中miR-3195表達較低，且miR-3195表達在中低分化、腫瘤浸潤T3～T4期、TMN分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的喉癌患者癌組織中表達相對較低，說明miR-3195表達與癌組織分化程度、腫瘤浸潤深度、TMN分期、淋巴結轉移情況等病理特征存在密切相關。

PINCH-1位于2q123-13染色體，在整合素、生長因子信號等傳導中有重要的連接作用，在腫瘤的發生、發展中有重要作用[19]。有學者研究認為，PINCH-1在喉癌患者癌組織中表達較高，PINCH-1表達與腫瘤浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移情況顯著相關，腫瘤浸潤深度(T3～T4期)、TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期)、PINCH-1高表達是喉癌患者危險因素，可影響患者預后[20]，亦有學者研究認為，喉癌患者癌組織PINCH-1呈現出高表達，能夠作為喉癌患者檢測的蛋白標記物，為喉癌患者的靶向治療提供新方向[21]。本研究顯示，喉癌癌組織中PINCH-1表達較高。本文研究還發現，PINCH-1在中低分化、腫瘤浸潤T3～T4期、TMN分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移的喉癌患者癌組織中表達相對較高，說明PINCH-1表達與癌組織分化程度、腫瘤浸潤深度、TMN分期、淋巴結轉移情況等病理特征存在密切聯系，在喉癌發生發展中具有重要作用。

綜上所述，AQP1、miR-3195、PINCH-1在喉癌組織中表達異常，且AQP1、miR-3195、PINCH-1表達變化與喉癌患者分化程度、腫瘤浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移情況相關，三者表達存在一定的相關性，共同參與喉癌的發展過程。