UPLC-QTOF-MS 結(jié)合主成分分析法考察胡蘆巴鹽制前后的化學(xué)成分差異

王祎，劉穎，葉斌斌，鄭彧

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

胡蘆巴為豆科植物胡蘆巴(Trigonellafoenum-graecumL.)的干燥種子，主要分布于我國(guó)寧夏、甘肅、青海、新疆、內(nèi)蒙古等省區(qū)，是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用植物和香料。《中國(guó)藥典》中載有胡蘆巴、鹽胡蘆巴兩個(gè)品種。胡蘆巴性溫味苦，歸腎經(jīng)，溫腎助陽(yáng)，祛寒止痛，用于腎陽(yáng)不足。在中醫(yī)理論中有“入鹽走腎臟仍仗軟堅(jiān)”，認(rèn)為鹽制可以引藥入腎，發(fā)揮軟堅(jiān)散結(jié)的作用。胡蘆巴經(jīng)鹽制后可以增強(qiáng)溫腎陽(yáng)、逐寒濕的功效[1]。我們課題組在早期研究中證明了鹽胡蘆巴的降脂作用優(yōu)于胡蘆巴[2]。胡蘆巴的化學(xué)成分主要包括胡蘆巴堿、皂苷類、黃酮類、膳食纖維、胡蘆巴油脂、4-羥基異亮氨酸等，這些化學(xué)成分已經(jīng)被報(bào)道具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗氧化、抑菌、保肝等多種藥理活性[3]。我們課題組早期基于響應(yīng)面法優(yōu)化了鹽胡蘆巴的炮制工藝[4]，并發(fā)現(xiàn)胡蘆巴鹽制后，多糖、薯蕷皂苷元、胡蘆巴堿含量升高，4-羥基異亮氨酸含量降低。

中藥的炮制在中國(guó)有著悠久的歷史，炮制通過(guò)促進(jìn)中藥中化學(xué)成分之間的轉(zhuǎn)化以及藥效成分的溶出，從而發(fā)揮減毒增效的作用[5]。例如，補(bǔ)骨脂經(jīng)鹽制總黃酮含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這可能是鹽制過(guò)程導(dǎo)致補(bǔ)骨脂種皮破碎，使得其成分更易溶出[6]；知母中的甾體皂苷類成分在鹽制過(guò)程中發(fā)生轉(zhuǎn)化[7]。目前，關(guān)于胡蘆巴鹽制后化學(xué)成分變化的研究較少。因此，本研究使用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UPLC-QTOF-MS) 分析胡蘆巴與鹽胡蘆巴中的化學(xué)成分，采用主成分分析(PCA)以及偏最小二乘判別分析(PLS-DA)篩選胡蘆巴與鹽胡蘆巴中的差異性成分，利用高分辨質(zhì)譜提供的精確分子量、二級(jí)質(zhì)譜結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)鑒定這些差異性成分的結(jié)構(gòu)。探究鹽制對(duì)胡蘆巴中化學(xué)成分的影響，為闡明胡蘆巴鹽制的機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 試藥

胡蘆巴購(gòu)自亳藥千草中藥飲片公司(批號(hào)：2008132，產(chǎn)地：安徽蒙城)經(jīng)王添敏教授鑒定為豆科植物胡蘆巴(Trigonellafoenum-graecumL.)的種子。參照課題組早期優(yōu)化的鹽制方法制備鹽胡蘆巴[4]，即：100 g 胡蘆巴， 加入含鹽量 2.0 g的鹽水，悶潤(rùn)4 h，在 160 ℃下烘箱烘制10.0 min。

2 方法

2.1 樣品制備 胡蘆巴和鹽胡蘆巴粉粹，過(guò)60目篩，精密稱定后以10倍量甲醇超聲提取30 min，18 000 g離心10 min取上清液(平行6份)進(jìn)Agilent Technologies 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS分析。取胡蘆巴和鹽胡蘆巴各樣品等量混合作為QC樣品。

2.2 色譜和質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 Agilent Technologies 6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS，離子源：electrospray ionization(ESI)。色譜柱：C18反相色譜柱(150 mm×3.0 mm，2.7 μm,YMC Co.,Ltd.)。柱溫40 ℃,流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量5 μL，流動(dòng)相：0.5% 乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，0～20 min,5%～100% B;20～25 min,100% B。

2.2.2 質(zhì)譜條件 離子源ESI(+)，毛細(xì)管電壓3.5 kV,碰撞電壓75 V，錐孔電壓65 V，霧化氣壓力35 psig，干燥氣流速8 L·min-1，干燥氣溫度350 ℃，掃描范圍m/z100～2 000。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 將UPLC-QTOF-MS 的結(jié)果加載到安捷倫MassHunter工作站軟件上，該軟件可以在分析的每個(gè)步驟中可視化原始數(shù)據(jù)，而不會(huì)丟失值。離子強(qiáng)度圖顯示了保留時(shí)間、m/z和強(qiáng)度的信息，以及用于進(jìn)一步分析的質(zhì)譜圖和色譜圖。將從UPLC-QTOF-MS 獲得的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為包含m/z、保留時(shí)間和離子強(qiáng)度信息的表格。從所有樣品中排除質(zhì)控樣品中RSD值大于30%的峰，并將剩余峰用于多元統(tǒng)計(jì)分析。將Simca-P 12.0軟件應(yīng)用于PCA和PLS-DA。然后選擇VIP值大于1.5、組間差異P值小于0.05的離子，通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜(MS2)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

3 結(jié)果

3.1 胡蘆巴和鹽胡蘆巴的PCA和PLS-DA分析 胡蘆巴和鹽胡蘆巴在正離子模式下的總離子流圖(TIC)見(jiàn)圖1所示。在胡蘆巴和鹽胡蘆巴TIC圖中9～11 min的離子響應(yīng)出現(xiàn)差異，提示鹽制使胡蘆巴中的化學(xué)成分發(fā)生變化。將各樣本的UPLC-QTOF-MS 數(shù)據(jù)導(dǎo)入XCMS(https://xcmsonline.scripps.edu) 轉(zhuǎn)換為包含m/z,保留時(shí)間和峰響應(yīng)的表格,將表格導(dǎo)入SIMCA軟件進(jìn)行PCA和PLS-DA分析。PCA分析結(jié)果表明胡蘆巴和鹽胡蘆巴樣本聚集良好。進(jìn)一步采用PLS-DA篩選胡蘆巴和鹽胡蘆巴中的差異性成分，選擇VIP值大于1.5、組間差異P值小于0.05的成分進(jìn)行鑒定。

A.胡蘆巴;B.鹽胡蘆巴圖1 胡蘆巴及鹽制品正離子模式下的總離子流圖

3.2 胡蘆巴和鹽胡蘆巴差異性成分鑒定 通過(guò)質(zhì)譜提供的精確分子量以及MS2數(shù)據(jù)，結(jié)合參考文獻(xiàn)，鑒定了胡蘆巴和鹽胡蘆巴中的25個(gè)差異性成分的結(jié)構(gòu)。化合物1為胡蘆巴堿[8]，是胡蘆巴中的主要活性成分。胡蘆巴中含有大量黃酮碳苷[9]，盡管本試驗(yàn)采用正離子模式測(cè)定胡蘆巴的化學(xué)成分，對(duì)于差異性成分中黃酮的鑒定則配合了負(fù)離子模式下的靶向二級(jí)質(zhì)譜。黃酮碳苷在負(fù)離子模式下易產(chǎn)生[M-H-90]-、[M-H-120]-、[M-H-60]-、[M-H-104]-等碎片，這些碎片信息提示黃酮碳苷中糖的類型.例如,[M-H-120]-和[M-H-90]-提示存在六碳糖苷，[M-H-90]-和[M-H-60]-提示存在五碳糖苷[10-11]。由于質(zhì)譜不能鑒定糖的種類和連接位置，因此胡蘆巴生、鹽品差異性黃酮類化合物的鑒定參考了文獻(xiàn)中報(bào)道的胡蘆巴中含有的黃酮碳苷的名稱以及其在C18柱上的保留時(shí)間，糖的結(jié)構(gòu)只鑒定了其類型。基于以上分析化合物2～8被鑒定為黃酮類化合物。化合物2和4在正離子模式和負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z595[M+H]+、593[M-H]-，提示其分子式為C27H30O15。MS2給出碎片離子峰m/z503[M-H-90]-、473[M-H-120]-、383[M-H-120-90]-、353[M-H-120-120]-。因此鑒定該兩個(gè)化合物為芹菜素-6,8-C-雙六碳糖苷，即vicenin 2或其異構(gòu)體[9]。 化合物3,5～8在正離子模式和負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z565[M+H]+、563[M-H]-，提示其分子式為C27H28O14。MS2給出碎片離子峰m/z503[M-H-60]-、473[M-H-90]-、443[M-H-120]-、383[M-H-120-60]-、353[M-H-120-90]-。因此鑒定該5個(gè)化合物為芹菜素-6-C-六碳糖-8-C-五碳糖苷或芹菜素-6-C-五碳糖-8-C-六碳糖苷，即vicenin 3、vicenin 1或其異構(gòu)體[9]。該7個(gè)黃酮碳苷類化合物在鹽胡蘆巴中的響應(yīng)較高，提示其鹽制后含量升高。

除黃酮碳苷外，胡蘆巴中還含有大量的甾體皂苷，苷元類型包括呋甾烷醇型(原diosgenin,yamogenin,neotigogenin,tigogenin,neogitogenin,gitogenin,smilagenin,sarsasapogenin)及其F環(huán)閉環(huán)的苷元即螺甾烷醇型/異螺甾烷醇型[12]。其中的呋甾烷醇型甾體皂苷在C22連有羥基，因此在質(zhì)譜中的準(zhǔn)分子離子峰為[M+Na]+同時(shí)還會(huì)觀察到其C22脫水的離子峰[M+H-H2O]+。在此基礎(chǔ)上162 Da的中性丟失生成碎片m/z[M+H-162]+提示其C26連有葡萄糖。而螺甾烷醇型/異螺甾烷醇型甾體皂苷在質(zhì)譜中可形成[M+Na]+,[M+H]+的準(zhǔn)分子離子峰，在此基礎(chǔ)上的144 Da中性丟失為E環(huán)開(kāi)裂產(chǎn)生[13-14]。甾體皂苷在質(zhì)譜中主要產(chǎn)生失去糖形成的碎片峰，[M+H-162]+、[M+H-146]+、[M+H-132]+分別提示存在六碳糖、甲基五碳糖和五碳糖。m/z415、m/z271(-C8H16O2,415-144 Da)、m/z253(-H2O,271-18 Da) 的碎片峰提示苷元為原yamogenin和原diosgenin以及yamogenin和diosgenin。m/z417、m/z273(-C8H16O2,417-144 Da)、(-H2O,273-18 Da)提示苷元為原neotigogenin和原tigogenin以及neotigogenin和tigogenin。m/z431、m/z287(-C8H16O2,431-144 Da)、m/z269(-H2O,287-18 Da)、m/z251(-H2O,269-18 Da) 提示苷元為原lilagenin和原yuccagenin以及l(fā)ilagenin和yuccagenin。m/z433、m/z415(-H2O,433-18 Da)、m/z289(-C8H16O2,415-144 Da)、m/z271(-H2O,289-18 Da)、m/z253(-H2O,271-18 Da) 提示苷元為原neogitogenin和原gitogenin以及neogitogenin和gitogenin。在上述苷元的碎片基礎(chǔ)上生成142 Da中性丟失碎片提示C25和C27之間存在雙鍵[13-14]。此外，在C18柱上25S構(gòu)型的甾體皂苷先于25R構(gòu)型的洗脫，中基于這個(gè)洗脫規(guī)律對(duì)甾體皂苷的C25差向異構(gòu)體進(jìn)行鑒定[13]。由于質(zhì)譜不能鑒定糖的結(jié)構(gòu)以及連接位置，因此在進(jìn)行甾體皂苷的鑒定時(shí)僅對(duì)糖的類型進(jìn)行了鑒定，如六碳糖、五碳糖、甲基五碳糖。基于以上分析，共鑒定胡蘆巴生、鹽品中的差異性皂苷15個(gè)。其中8個(gè)為呋甾烷醇型甾體皂苷，7個(gè)在鹽制后響應(yīng)降低；7個(gè)為螺甾烷醇/異螺甾烷醇型甾體皂苷，在鹽制后響應(yīng)升高。推測(cè)胡蘆巴中的呋甾烷醇型甾體皂苷在鹽制過(guò)程中失去C26位葡萄糖，隨后發(fā)生側(cè)鏈環(huán)合，生成螺甾烷醇/異螺甾烷醇型甾體皂苷。

4 討論

對(duì)胡蘆巴及其鹽制品的化學(xué)成分分析結(jié)果表明，胡蘆巴經(jīng)鹽制后化學(xué)成分的含量發(fā)生變化，但機(jī)制不同。黃酮碳苷在鹽制后響應(yīng)升高、但在生品、鹽品中均存在、并且差異性黃酮類化合物種并無(wú)炮制后響應(yīng)降低的成分，提示黃酮碳苷類成分炮制后響應(yīng)升高的原因?yàn)辂}制使種質(zhì)疏松、溶出增加。而呋甾烷醇型甾體皂苷結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在加熱過(guò)程中容易轉(zhuǎn)化為螺甾烷醇型/異螺甾烷醇型甾體皂苷[15]。因此螺甾烷醇型甾體皂苷在鹽品中響應(yīng)升高，而呋甾烷醇型甾體皂苷在生品中響應(yīng)降低。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道在胡蘆巴中分離得到呋甾烷醇型甾體皂苷以及螺甾烷醇型/異螺甾烷醇型甾體皂苷[12，16]，表明這一轉(zhuǎn)化過(guò)程既可能發(fā)生在炮制過(guò)程中，也可能發(fā)生在對(duì)生品藥材的提取過(guò)程中。本試驗(yàn)采用的樣品為甲醇超聲提取獲得，采用UPLC-QTOF-MS 分析生品樣品中含有多種呋甾烷醇型甾體皂苷，而這些皂苷在鹽制后響應(yīng)降低，提示在本試驗(yàn)條件下觀察得到的甾體皂苷含量及種類的變化是由炮制導(dǎo)致的。

表1 胡蘆巴及其鹽制品之間的差異性成分