長鏈非編碼RNA LINP1抑制DNA損傷促進非小細胞肺癌電離輻射抗性

張春婷 梁梟婷 王樂 周良

南方醫科大學公共衛生學院（廣東省熱帶病研究重點實驗室）毒理學系（廣州 510515）

肺癌是對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，死亡率僅次于心臟病，在所有腫瘤中發病率和病死率最高[1-2]，其中非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見的組織學亞型，約占肺癌發病率的85%[3]。目前，肺癌的治療手段主要是手術、放療、化療等。由于早期NSCLC患者癥狀隱匿，確診時大多已是晚期，病情發展迅速、預后差，無法施行手術治療，因此較依賴于放射治療[4]。直接或者間接造成DNA損傷從而消滅腫瘤細胞是放射治療的主要殺傷機制，然而大多數晚期肺癌對放射治療具有較高的抗性，患者5年生存率很低[5-6]。因此，如何減弱NSCLC患者放療抗性是目前肺癌治療中亟需解決的重要課題，研究影響NSCLC放射治療下DNA損傷效應的因素，尋找更有效的治療靶點，對降低NSCLC患者電離輻射抗性、促進NSCLC的臨床治療提供新思路具有重要意義。

近年來，生物靶向治療日益成熟，其與放射治療的聯合運用的研究也受到廣泛關注[7-8]。長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）是一類轉錄本長度大于200個核苷酸、不具備蛋白編碼能力的RNA分子[9-10]。異常的LncRNA表達可能參與誘導或抑制癌癥的發生發展、轉移和化學抗性的產生[11-12]。非同源末端連接途徑長鏈非編碼 RNA 1（lncRNA in non?homologous end joining pathway 1，LINP1）與多種腫瘤的進展密切相關，其表達和功能受p53和表皮生長因子受體信號調節[13-15]。沉默LINP1會增加腫瘤細胞對乳腺癌放療的敏感性[16]。在胰腺癌中，LINP1能夠通過調節microRNA?491?3p來增強細胞的增殖和轉移，從而影響患者的淋巴結或遠處轉移的發生率和預后[17]。在食管鱗狀細胞癌中[13]，敲減 LINP1 可以抑制食管鱗狀細胞癌的惡性進展，且LINP1能作為其預后指標。在甲狀腺癌中[18]，高表達的LINP1通過抑制AMPK信號通路促進細胞的增殖并阻抑其凋亡。目前，LINP1對肺癌進展尤其是對肺癌放療抗性的影響尚未明確。

本研究比較了NSCLC細胞在模擬放射治療條件下電離輻射照射后LINP1表達水平的變化，分析了在電離輻射條件下，敲減LINP1對肺癌細胞H1299的活力和DNA損傷效應的影響。通過研究LINP1在放射治療中對NSCLC的DNA損傷和電離輻射抗性的影響，為NSCLC的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料H1299細胞購自上海啟達生物科技有限公司。1640培養基（美國Gibco公司），小牛血清（上海依科賽生物有限公司），磷酸鹽緩沖液（PBS），胰蛋白酶（美國 Gibco公司）；結晶紫（美國Roche公司）；蛋白酶抑制劑（美國Roche公司）；CCK?8試劑盒（北京TransGen Biotech公司）；EL轉染試劑（北京TransGen Biotech公司）；ECL顯色液（德國Merck Millipore公司）；二氧化碳培養箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養H1299細胞5% CO2，37℃條件下，用含10%小牛血清的1640培養基培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 細胞轉染使用siRNAs（siNC，siLINP1?1，siLINP1?2）和轉染試劑EL敲減LINP1。細胞培養到匯合度達到70% ～80%時，用siNC，siLINP1?1，siLINP1?2分別與EL按操作手冊的要求混合后進行轉染，6 h后換完全培養基繼續培養。

1.2.3 細胞照射將細胞接種于培養皿中，貼壁24 h后進行siRNA的轉染，使用siRNAs（siNC，siL?INP1?1，siLINP1?2）和EL敲減LINP1。細胞培養到匯合度達到70% ～ 80%時，用siNC，siLINP1?1，siL?INP1?2分別與EL混合后進行轉染，6 h后換完全培養基繼續培養。24 h后換液，液面深度為5 mm，上蓋1 cm玻璃厚補償物，使用Elekta Precise醫用直線加速器radiation type X ray，Energy 6 MV，Dose Rate 300 MU/min，0 °照射，劑量為8.0 Gy。

1.2.4 CCK?8法檢測細胞增殖采用上述成功轉染后的細胞，按照按每孔5×103個細胞接種在96孔板中，每孔100 μL的細胞懸液，培養24 h后進行電離輻射（8.0 Gy）照射，分別在照后0、12、24、48、72 h各時間點每孔加入10 μL的 CCK?8溶液，繼續培養2 h，測定450 nm的吸光度值。實驗重復3次。

1.2.5 克隆形成實驗取上述成功轉染的細胞使用胰酶消化后計數，每孔5.0×102個細胞接種培養在6孔板中，24 h后進行電離輻射（8.0 Gy）的照射，培養12～14 d，中間更換兩次培養基。克隆集落出現后，用PBS洗滌兩次，在4%多聚甲醛中固定15 min，最后0.1%結晶紫染色15min后觀察，評估LINP1表達水平變化對細胞克隆形成能力的影響。

1.2.6 Western blot蛋白檢測2 500 rpm離心收集細胞，用加有 1×Protease Inhibitor Cocktail（Roche）的RIPA緩沖液制備細胞裂解液，提取細胞總蛋白。每孔加20 μg等量蛋白，電泳后轉（PVDF）膜上，3%BSA室溫封閉1 h，特異性一抗結合靶蛋白4℃孵育過夜，TBST漂洗后辣根過氧化酶（horse?radish peroxidase，HRP）偶聯的二抗用于化學發光成像檢測，ECL發光試劑盒檢測發光強度。

1.2.7 單細胞凝膠電泳細胞轉染6 h后換液，24 h后進行電離輻射（8.0 Gy）的照射，4 h后使用胰酶將細胞消化后用PBS將細胞重懸，將細胞懸液和0.8%低熔點瓊脂糖按照1∶4混合均勻，鋪在預處理后的載玻片上，4℃下放置1 h。將鋪好膠的載玻片放入裂解液中裂解4 h。裂解后用PBS清洗，將載玻片放入現配現用的電泳緩沖液中，變性解旋 20 min，電泳 20 min（20 V，300 mA）。用中和緩沖液中和15 min，全程避光進行。將載玻片置于EB中染色20 min后洗脫10 min，使用熒光倒置顯微鏡拍照后，用分析軟件Image J進行圖像分析。

1.2.8 實時定量PCR（qRT?PCR）檢測qRT?PCR參照 HAN 等[19]的方法，用 TRIzol試劑（Life Tech?nologies）按說明書操作提取總RNA，采用Nanodrop 2000（ThermoFisher Scientific）定量RNA的濃度，取1 μg總RNA使用Honor II 1st cDNA Synthesis Super?mix for qPCR（Novogene）按說明書進行逆轉錄反應，所得cDNA稀釋10倍用于后續反應。按每孔混合 3 μL 稀釋后的 cDNA、0.2 μL 引物和 5 μL Unique Apatamer qPCR SYBR Green Master Mix（No?vogene）并加ddH2O至體積10 μL配制反應體系，置于qPCR儀LightCycler 480 PCR System（Roche），按程序（預變性：94℃ 3 min；擴增：94℃ 10 s，56℃15 s，72 ℃ 30 s，40個循環；72 ℃，7 min；12 ℃保溫）進行qRT?PCR檢測和分析。

1.3 統計學方法采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。多個實驗組與對照組均數的比較采用方差分析的Dunnett?t檢驗，兩樣本均數的比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 電離輻射條件下肺癌細胞中LINP1的表達水平為了探索LINP1在NSCLC電離輻射抗性中的作用，首先分別收集了0、2.0、4.0、8.0、16.0 Gy照射后的H1299細胞，并通過qRT?PCR檢測電離輻射條件下肺癌細胞中LINP1的表達水平，結果顯示：照射后LINP1的表達均明顯升高，提示LINP1可能在NSCLC的電離輻射抗性中發揮作用。且在8.0 Gy電離輻射照射下，細胞中LINP1的表達量最高（圖1），因此后續選擇8.0 Gy作為照射劑量。

圖1 qRT?PCR檢測電離輻射條件下H1299細胞中LINP1的表達水平Fig.1 Expression of LINP1 in H1299 cells under ionizing radiation assessed by qRT?PCR

2.2 敲減LINP1抑制電離輻射條件下H1299細胞的增殖能力本研究使用RNA干擾在H1299細胞中沉默LINP1，并采用qRT?PCR驗證了敲減效率（圖2）。為了研究LINP1對電離輻射條件下非小細胞肺癌增殖能力的影響，對轉染24 h后的H1299細胞進行8.0 Gy電離輻射照射，采用CCK?8方法和克隆形成實驗對其增殖能力進行分析，其結果顯示：8.0 Gy照射后H1299細胞的增殖能力明顯下調，且敲減組相比siNC組增殖能力（圖3A）和克隆形成能力（圖3B）進一步降低。以上結果表明敲減LINP1抑制電離輻射條件下H1299細胞的增殖。

圖2 qRT?PCR檢測H1299細胞中LINP1的敲減效率Fig.2 Expression of LINP1 in H1299 cellsafter LINP1 knockdown assessed by qRT?PCR

圖3 電離輻射條件下敲減LINP1后對H1299細胞增殖能力和克隆形成的影響Fig.3 Effect of LINP1 knockdown on proliferation and clone formation of H1299 cells under ionizing radiation

2.3 敲減LINP1促進電離輻射下肺癌細胞的DNA損傷本研究通過彗星電泳和Western blot蛋白檢測DNA損傷修復相關蛋白γ?H2AX來觀察肺癌細胞H1299中DNA損傷的變化情況。彗星電泳結果顯示：8.0 Gy照射組的彗星拖尾更長，Tail DNA%、Tail Length、Comet Length、Tail Moment、Olive Tail Moment這5個特異指標明顯升高（表1），DNA損傷明顯增加；且電離輻射條件下，與轉染siNC的H1299細胞相比，轉染siLINP1?1和siLINP1?2的H1299細胞5個特異指標明顯進一步升高，DNA損傷進一步增加，差異有統計學意義（P＜0.01，圖4）。Western blot結果顯示8.0 Gy電離輻射條件下γ?H2AX蛋白表達明顯增加；在電離輻射條件下敲減LINP1進一步提高了γ?H2AX的表達（圖5）。以上結果說明敲減LINP1能進一步增加電離輻射條件下H1299的DNA損傷。

表1 彗星電泳分析電離輻射條件下敲減LINP1后H1299細胞各指標的影響Tab.1 Comet electrophoresis analysis of the effects of LINP1 knockdown on various indicators of H1299 cells under ionizing radiation ±s

表1 彗星電泳分析電離輻射條件下敲減LINP1后H1299細胞各指標的影響Tab.1 Comet electrophoresis analysis of the effects of LINP1 knockdown on various indicators of H1299 cells under ionizing radiation ±s

注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P ＜0.001

組別0 Gy?siNC 0 Gy?siLINP1?1 0 Gy?siLINP1?2 8.0 Gy?siNC 8.0 Gy?siLINP1?1 8.0 Gy?siLINP1?2 Comet Length 257.56±9.82 305.80±6.23*301.13±9.76***412.65±9.95***376.41±10.43***412.90±10.58 Tail Length 12.73±10.67 30.17±10.20***30.15±7.73***63.48±9.60***81.75±8.80***75.11±9.28***Tail DNA Percent%5.01±2.94 11.02±9.06***13.90±8.91***13.61±7.00***20.59±7.02***25.99±8.28***Tail Moment 22.74±5.94 29.67±9.39*38.59±10.91***38.93±9.72***40.80±9.65 45.73±10.62**Olive Tail Moment 12.86±8.35 20.28±8.20***18.98±3.87**31.65±7.71***36.48±8.79*44.10±8.85***

圖4 彗星電泳檢測電離輻射條件下敲減LINP1后H1299細胞DNA損傷變化情況Fig.4 DNA damage of H1299 cells with LINP1 knockdown under ionizing radiation detected by Comet assay

圖5 Western blot檢測電離輻射條件下敲減LINP1后H1299細胞蛋白γ?H2AX的變化Fig.5 The changes of γ?H2AX of H1299 cells with LINP1 knockdown under ionizing radiation detected by Western blot

3 討論

放射治療是利用放射線如放射性同位素產生的射線和各類X線治療機或加速器產生的X線、電子束、質子束及其他粒子束等治療疾病，是惡性腫瘤治療的重要方法之一，可用于治療幾乎所有類型的實體瘤，為腫瘤的治療提供了更簡單更安全有效的治療方案。隨著特異性增強靶區劑量、減少周邊組織和器官非特異性損傷的放療技術的迭代更新，放療技術日趨完善，在臨床癌癥治療中得到了更廣泛的應用[9]。然而晚期肺癌對放射治療不敏感，具有電離輻射抗性是一大問題。而放射治療的主要作用靶點是癌細胞的DNA，引起DNA損傷，進而殺死癌細胞，因此如何增加電離輻射對癌細胞的DNA損傷是研究如何減弱電離輻射抗性的關鍵。隨著近年來生物靶向治療結合放射治療受到越來越廣泛的關注[20-21]，長鏈非編碼RNA在DNA損傷和電離輻射抗性中發揮的作用也逐漸被揭示。

在本研究中首先通過梯度劑量照射處理后發現LINP1顯著升高，并且8.0 Gy電離輻射處理下最為明顯。LINP1作為一種在三陰性乳腺癌（TNBC）中促進治療耐藥性的LncRNA首次被發現，研究表明LINP1能夠通過充當Ku80和DNA?PKcs的連接支架來增強DNA雙鏈斷裂的修復，并且結合依賴ATP的DNA螺旋酶復合物Ku80?Ku70異質二聚體，與斷裂的末端結合，形成一個鉗形復合體，將依賴DNA的蛋白激酶催化亞基DNA?PKcs招募至損傷部位，促進斷端的連接修復，從而協調非同源末端連接（NHEJ）途徑[22]。此外，有研究在宮頸癌放射治療中，LINP1從細胞質轉位至細胞核結合Ku80和DNA?PKcs以促進放療時的DNA損傷修復，敲減LINP1的表達則顯著增強電離輻射后細胞凋亡水平，進而降低宮頸癌細胞對電離輻射的敏感性[23]。以上研究提示LINP1在DNA損傷及輻射抗性中可能發揮著作用，但目前關于LINP1與NSCLC DNA損傷以及輻射抗性的研究幾乎未見有，因此本文研究了LINP1對電離輻射下NSCLC DNA損傷效應的影響，探索能夠增強NSCLC放射敏感性的治療方案。

本研究首先通過qRT?PCR檢測電離輻射對肺癌細胞中LINP1表達情況的影響，結果顯示，在電離輻射條件下肺癌細胞中LINP1的表達上調，提示電離輻射與LINP1的變化有明確的誘導關系。在通過siRNA敲減LINP1表達后，電離輻射條件下的NSCLC H1299的增殖能力和克隆形成能力進一步下降，提示敲減LINP1能夠進一步加強電離輻射對NSCLC增殖的抑制作用，這與LINP1在宮頸癌中的研究結果一致。

在明確LINP1能增強細胞的增殖能力后本研究對H1299細胞的DNA損傷和DNA損傷修復進行了探索。彗星電泳實驗發現敲減LINP1能夠增強電離輻射對NSCLC的DNA損傷作用。當DNA發生內源性或外源性損傷時，形成雙鏈斷裂（DS?Bs），組蛋白H2AX發生磷酸化。這種新磷酸化的蛋白質γ?H2AX是招募和定位DNA修復蛋白的第一步。γ?H2AX病灶迅速形成，這些病灶以1∶1的方式代表DSB，可以用作損傷的生物標志物[24-25]。Western blot結果表明在電離輻射條件下，敲減LINP1后γ?H2AX的表達增加，進一步說明LINP1可能通過DNA損傷和DNA損傷修復相關通路來抑制NSCLC細胞DNA損傷效應從而導致電離輻射抗性的產生。

綜上所述，本研究探討了LINP1電離輻射條件下在NSCLC中的生物學作用，揭示了LINP1抑制NSCLC中DNA損傷增強其電離輻射抗性的作用，為NSCLC患者尤其是晚期患者的電離輻射治療與抑制LINP1的生物靶向治療的聯合應用提供新的思路和科學依據，但目前本研究結論待體內實體瘤實驗中進一步充實，其具體是通過何種機制發揮DNA損傷抑制作用及電離輻射抗性作用有待更進一步研究。