LC-MS/MS 法測定人血漿中米拉貝隆及其中國健康人體藥動學研究

陳 敏，范宇軒，程旻露，劉海俊，丁 黎*

1珠海同源藥業有限公司，廣東珠海 519041；2 中國藥科大學藥物分析研究室，南京 211100；3 南京科利泰醫藥科技有限公司，南京211100

膀胱過度活動癥（OAB）是以尿頻、夜尿、急迫性尿失禁等癥狀為特征的綜合征[1]。2011 年的臨床問卷調查結果顯示，中國人OAB 的總發病率為6.0%[2]。米拉貝隆（mirabegron）是第一個用于治療OAB 的高選擇性β3 受體激動劑（結構式見圖1），與現行的OAB 一線藥物抗膽堿能藥相比，該藥不良反應發生率低，具有良好的應用前景[3]。目前，在已有的米拉貝隆LC-MS/MS 檢測文獻中，所采用的樣品前處理方法有液液萃取法（LLE）[4]、固相萃取法與固相支撐-液液萃取法（SLE）[5]。這些方法前處理時間較長、操作較繁瑣、成本較高，具有一定的局限性；其次米拉貝隆結構中的酰胺鍵可能被血漿中的酯酶水解，影響檢測的穩定性。本研究設計了在冰浴上操作并在血漿樣品中加入氟化鈉作為酯酶抑制劑來穩定米拉貝隆的樣本處理技術，建立蛋白沉淀血漿樣品前處理方法，用于人血漿中米拉貝隆的LC-MS/MS 濃度測定，并應用于米拉貝隆緩釋片在中國健康人體內的藥動學研究。

圖1 米拉貝隆結構式

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

米拉貝隆對照品（批號：2-KME-45-1，純度：99.90%，TRC）；米拉貝隆-d5（內標，批號1961-094A3，純度：99.5%，TLC）；米拉貝隆緩釋片（貝坦利?，批號20I2035，Avara Pharmaceutical Technologies Inc）。乙腈、甲醇、異丙醇為色譜純；甲酸、醋酸銨（美國化學協會標準試劑）；超純水。

1.2 儀器與設備

島津高效液相色譜儀（LC-30AD 液相泵，CTO-20AC 柱溫箱，CBM-20A Lite 控制器，DGU-20A5R脫氣機，SIL-30AC 自動進樣器）；質譜儀（Triple QuadTM5500，Applied Biosystems/Sciex，USA）；色譜工作站：Analyst 1.6.2、Analyst 1.6.3；數據處理軟件：Microsoft Office 2013 或他版本，Watson LIMS 7.5 SP1；主要藥代動力學參數使用Phoenix Win-Nonlin software（version 7.5）處理。

1.3 檢測條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：ACE Excel 3AQ（100 mm×2.1 mm，Advanced Chromatography Technologies）；預柱：Security Guard Cartridges C18（4mm×2.0 mm，Phenomenex）；流動相A 為含0.1%甲酸和5.00 mmol·L-1醋酸銨的水溶液，流動相B 為含0.1%甲酸和5.00 mmol·L-1醋酸銨的90%乙腈水溶液；柱溫40℃；流速0.400 mL·min-1；進樣體積10 μL；自動進樣器溫度8℃。

梯度洗脫程序：0.00～0.30 min，10% B；0.30～0.40 min，10%～18% B；0.40～2.70 min，18% B；2.70～2.80 min，18%～90% B；2.80～3.70 min，90% B；3.70～3.80 min，90%～10% B；3.80～5.00 min，10% B。

1.3.2 質譜條件 采用電噴霧離子化，正離子模式，多反應監測，裂解電壓2500 V，氣簾氣壓力206.85 kPa，霧化氣壓力344.75 kPa，輔助氣壓力413.7 kPa，干燥氣溫度600℃，檢測反應離子對：米拉貝隆m/z 397.2→260.0，米拉貝隆-d5 m/z 402.2→260.0。米拉貝隆質譜參數DP：92V；EP：5V；CE：27V；CXP：20 V。米拉貝隆-d5 質譜參數DP：92 V；EP：5 V；CE：27 V；CXP：20 V。0.8 min 切入質譜，3.5 min 切出質譜，共采集2.7 min。

1.4 溶液的配制

采血使用預冷的含氟化鈉的肝素鈉（抗凝劑）真空管，4℃、2000 g 離心10 min，將上層血漿在冰浴條件下轉移至凍存管中得到空白健康人血漿。米拉貝隆及內標儲備液與工作溶液的配制：精密稱取米拉貝隆對照品適量，經質量校正系數校正后，用100%甲醇溶解配制成濃度為1.00 mg·mL-1的儲備液，用50%甲醇逐級稀釋，得到濃度范圍為3.20 ng·mL-1～1700 ng·mL-1的標曲及質控工作溶液以及40.0 ng·mL-1的內標工作溶液。儲備液于-20°C 下在棕色玻璃瓶中長期保存，質控工作溶液于-20°C 下在透明聚丙烯管中保存。在方法驗證中，將相應的工作溶液加入到上述空白人血漿中，每天新鮮配制。

1.5 血漿樣品的前處理

在冰浴條件下，于96 孔板中加入50.0μL 血漿樣品和25.0μL 內標工作溶液（40.0ng·mL-1），混勻1min后加入175 μL 甲醇，將密封后的96 孔板在振蕩器上振搖10 min，再以25℃、4000 r·min-1離心10 min，取50.0 μL 上清液轉移至含有150 μL 超純水的另一96 孔板中，渦旋混勻后行LC-MS/MS 分析。

1.6 米拉貝隆的藥動學研究

試驗方案經成都中醫藥大學附屬醫院倫理委員會審核批準，臨床注冊號為CTR20201584。試驗為單中心、健康受試者藥代動力學研究。共入選20名中國健康受試者，男女皆有，漢族，年齡22～49歲，男性體重≥50 kg，身高160～175 cm，女性體重≥45 kg，身高154～162 cm，體重指數（BMI）在19.0～26.0 kg·m-2。受試者簽署知情同意書。符合入組要求的受試者于試驗前一日進入Ⅰ期臨床試驗病房，隔夜禁食10 h，空腹口服米拉貝隆緩釋片50 mg，240 mL溫水送服。于0 h（服藥前1 h 內）、服藥后0.5、1.0、1.5、2.0、2.33、2.67、3.0、3.33、3.67、4.0、4.33、4.67、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0、24.0、36.0、48.0、72.0、96.0 h共24 個點各采集靜脈血3 mL，樣品置含氟化鈉的肝素鈉采血管并立即放入冰浴中，1 h 內轉移至預冷的離心機，4℃、2000 g 離心10 min，取1 mL 上層血漿在冰浴下轉移到凍存管，儲存于-70℃超低溫冰箱。以LC-MS/MS 法測定血漿中米拉貝隆的濃度供藥動學分析。

2 方法學驗證及結果

2.1 標準曲線及定量下限

配制含米拉貝隆對照品濃度分別為0.160、0.320、1.50、6.00、25.0、50.0、85.0 ng·mL-1的標準含藥血漿，按“1.5”項前處理后進樣檢測，記錄色譜圖，計算米拉貝隆色譜峰面積As和內標峰面積Ai的比值f（f=As/Ai），以峰面積比值f 對米拉貝隆的血藥濃度X（ng·mL-1）為橫坐標，待測物與內標面積比值Y為縱坐標，用加權（W=1/x2）最小二乘法進行回歸運算，求得標準曲線方程為：Y=0.07142X+8.467×10-4，r2=0.998 1。結果表明，藥物濃度在0.160～85.0 ng·mL-1范圍內線性關系良好，定量下限（LLOQ）為0.160 ng·mL-1，連續測定3批，每批6份，LLOQ 樣品批內平均準確度為98.3%，批間準確度為98.1%。

2.2 選擇性

取空白人血漿，按選定的色譜條件，將空白血漿、空白血漿+米拉貝隆定量下限標準曲線樣品、內標，按“1.5”項前處理后進樣檢測，考察方法的選擇性。作為不含待測物及內標的雙空白樣品在待測物或內標保留時間附近，應不出現顯著干擾。結果表明，本實驗條件下，米拉貝隆出峰時間在2.62 min 左右，內標出峰時間在2.57 min 左右，峰形良好，在出峰位置無雜峰干擾測定，基線平穩，色譜圖見圖2。

圖2 血漿中米拉貝隆（Ⅰ）以及內標（米拉貝隆-d5）（Ⅱ）的典型的MRM 色譜圖

2.3 精密度及準確度試驗

用6 個重復的質控樣品0.160 ng·mL-1（LLOQ QC），0.450 ng·mL-1（LQC），5.00 ng·mL-1（GMQC），20.0 ng·mL-1（MQC），64.0 ng·mL-1（HQC）分別按“1.5”項進行前處理，根據隨行標準曲線求得實測濃度，在同一分析批中和連續3 個分析批中評估批內與批間的準確度與精密度，結果見表1。

表1 血漿中米拉貝隆LC-MS/MS 測定的精密度與準確度

2.4 穩定性試驗

考察人血漿中米拉貝隆在冰浴21.8h、室溫3.4h、-20℃下5 個凍融循環的穩定性，以及在-20℃下81天的長期穩定性。共考察低濃度質控樣品（LQC）和高濃度質控樣品（HQC）兩個濃度水平，每個濃度水平3 個重復，在不同條件下，各濃度水平的測定值與理論值的平均偏差均在±15%范圍內，表明人血漿中米拉貝隆在各實驗條件下均穩定，其數據見表2。

表2 米拉貝隆的血漿穩定性

2.5 提取回收率試驗

通過比較單個質控樣品中待測物或內標響應值與提取后加入待測物、內標的雙空白樣品的響應值，來評價樣品的提取回收率。共考察3 個濃度的質控樣品（0.450、20.0、64.0 ng·mL-1），每個濃度樣品進行6 次重復樣本分析。所有濃度的血漿樣品中米拉貝隆的提取回收率為95.7%～99.4%，精密度RSD為1.9%<15.0%，說明該方法的提取回收率良好。

2.6 基質效應

使用6 個不同來源的空白人血漿，來考察內標工作液濃度下和待測物低（LQC）、中（MQC）、高（HQC）濃度下的基質效應。計算每個來源空白基質存在下的峰面積與不含基質的樣品（相同濃度米拉貝隆標準品及其內標的混合純溶液）相應峰面積的比值，得到每一待測物和內標的基質因子，再用待測物的基質因子除以內標的基質因子，計算經內標歸一化的基質因子，結果為（101.3±10.8）%，表明血漿中內源性物質不干擾測定，而基質效應可以忽略不計。

2.7 殘留效應

以進樣定量上限樣品（ULOQ）85.0 ng·mL-1后，隨即進樣雙空白樣品的進樣序列，循環進樣6次，考察方法的殘留效應，6 個雙空白樣品中待測物的平均峰面積響應值與同分析批定量下限樣品平均峰面積響應值的比值為5.4%（20.0%）。結果表明，ULOQ 樣品后的空白血漿提取物在待測物出峰位置無干擾，表明該方法殘留效應符合要求。

3 藥代動力學研究

按“1.5”項下方法處理樣品并測定濃度，隨行標準曲線定量上限樣品與定量下限樣品的批內平均準確度分別為99.8%與100.49%。主要藥代動力學參數使用Phoenix WinNonlin software（version 6.4）依賴非房室模型計算，20 名受試者血漿中米拉貝隆的平均藥-時曲線見圖3，其藥代動力學參數見表3。

表3 米拉貝隆的主要藥代動力學參數（n=20）

圖3 20 名健康受試者空腹口服米拉貝隆緩釋片50 mg 后米拉貝隆的血藥濃度均值-時間曲線

4 討論

本研究開發了成本較低、操作簡單、前處理時間較短的蛋白沉淀法，且所建立的檢測方法準確度好、靈敏度高。人血漿中常含有羧酸酯酶，主要對包含酯鍵、酰胺類、氨基甲酸酯和硫代酸酯類結構的藥物有水解作用，因此米拉貝隆結構中的酰胺鍵在血漿中不穩定，易被水解。抑制酯酶水解的方法通常為冰浴、加酸或添加酯酶抑制劑，本研究采取冰浴以及在全血采集時向肝素鈉采血管中加入氟化鈉作為酯酶抑制劑的方法，可以有效地防止米拉貝隆被人血中的酯酶水解。在米拉貝隆緩釋片單劑量空腹口服給藥條件下，中國健康人體藥代動力學特征鮮有報道，查閱文獻可知相同給藥劑量空腹條件下日本受試者[4]以及歐洲受試者[6]的tmax均值為3.5、3.95h，t1/2均值分別為39.3、43.8h，AUC0-∞分別為387.1、241.9h·ng·mL-1，可發現3 個不同地域的受試者達峰時間接近，歐洲人的半衰期較長、暴露量較低。本試驗結果可為米拉貝隆人血漿濃度檢測及臨床應用的安全性、有效性研究提供一定的參考。