敲低長(zhǎng)鏈非編碼RNA CCAT2 抑制胃癌細(xì)胞的糖代謝重編程和增殖能力

鄧 歡，曹 博，崔 昊，趙瑞陽(yáng)，李航航，劉貴賓，宋立強(qiáng)，陳 凜，衛(wèi) 勃

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 普通外科醫(yī)學(xué)部，北京 100853

早期胃癌一般無(wú)明顯癥狀，產(chǎn)生明顯不適癥狀時(shí)多處于中晚期，因此多數(shù)患者預(yù)后較差，5年生存率往往低于50%[1-2]。胃癌的發(fā)病及分子演化機(jī)制目前尚不明確，揭示這些機(jī)制對(duì)于胃癌的防治具有深遠(yuǎn)的臨床意義[3]。大量研究表明有氧糖酵解在胃癌的發(fā)展中具有重要作用，是癌細(xì)胞主要的供能來(lái)源[4]。糖酵解是一個(gè)十分復(fù)雜的能量代謝過(guò)程，其機(jī)制復(fù)雜，靶點(diǎn)眾多。lncRNA 是一類長(zhǎng)度＞200個(gè)核苷酸，本身不編碼蛋白的分子。既往研究表明，lncRNA 在多種腫瘤組織中異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，參與腫瘤的惡性生物學(xué)行為的調(diào)控[5-7]。大量研究表明lncRNA在糖酵解的調(diào)控中起到重要作用[4,8-9]。本研究重點(diǎn)關(guān)注lncRNA CCAT2 這一關(guān)鍵靶點(diǎn)，探究其與胃癌惡性生物學(xué)行為及糖酵解的關(guān)系，為胃癌的發(fā)病機(jī)制研究提供新的理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1 主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器 TRIzol 試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自天津康源科技有限公司；青霉素-鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 及蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司。靶向lncRNA CCAT2 的siRNA、對(duì)照siRNA 由武漢金拓思生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成；lncRNA CCAT2 引物由北京博邁德基因技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成；反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR 試劑盒購(gòu)自日本Takara 公司。葡萄糖、乳酸、丙酮酸、ATP 含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Biovision 公司。全波譜酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek 公司。GLUT1、HK2、PGAM1、β-actin 抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司，LDHɑ抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗及CCK-8 增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京百瑞極生物技術(shù)有限公司；ECL 發(fā)光試劑盒和EdU 增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。數(shù)碼凝膠圖形分析系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國(guó)Thermo Fisher 公司產(chǎn)品；qRTPCR 檢測(cè)儀購(gòu)自鯤鵬基因(北京) 科技有限責(zé)任公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海)的BGC-823、HGC-27 兩種常用胃癌細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。使用含有10 %胎牛血清和青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 培養(yǎng)基孵育細(xì)胞，并生長(zhǎng)于37℃含5% CO2加濕培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)1～ 3 d 后根據(jù)細(xì)胞密度進(jìn)行傳代或后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 為防止脫靶效應(yīng)的出現(xiàn)，本研究設(shè)計(jì)兩個(gè)靶向CCAT2 的siRNA 敲低胃癌細(xì)胞系內(nèi)lncRNA CCAT2 的表達(dá)水平。根據(jù)轉(zhuǎn)染的siRNA種類不同將細(xì)胞分為siRNA 干擾組(siCCAT2-1，siCCAT2-2)和陰性對(duì)照組(NC)。轉(zhuǎn)染前1 d 分別將兩種細(xì)胞按(3～ 5)×104/孔種植于6 孔板中，24 h后細(xì)胞密度達(dá)到60%～ 70%，更換為無(wú)血清培養(yǎng)基。按照轉(zhuǎn)染試劑操作說(shuō)明書，Opti-MEM 溶液中加入75 pmol/L Oligo 使終體積為100 μL，輕柔混勻；向Opti-MEM 溶液中加入7.5 μL Lipofectamine 2000，使終體積為100 μL，輕柔混勻，室溫放置5 min。將siRNA 分別與Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫放置20 min 后分別加至各組培養(yǎng)孔中。轉(zhuǎn)染后6～ 8 h 更換無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基，48 h 后收集細(xì)胞，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4 RNA 提取和定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRTPCR)使用TRIzol 試劑從細(xì)胞中提取總RNA。使用ExScript RT-PCR 試劑盒將lncRNA CCAT2逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并配置 PCR 反應(yīng)體系。然后應(yīng)用SYBR 預(yù)混Ex TaqⅡ(日本Takara 公司)后進(jìn)行擴(kuò)增，以β-actin 作為內(nèi)參，檢測(cè)lncRNA CCAT2的表達(dá)情況。用比較Ct 值的方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增條件：預(yù)變性 95℃ 1 min，PCR 反應(yīng)95℃ 20 s、60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)(引物序列見表1)。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，采用2-△△Ct法計(jì)算 lncRNA CCAT2 的相對(duì)表達(dá)量。

表1 siRNA 的序列及qRT-PCR 引物Tab.1 siRNA and primers sequences

5 Western blot 法檢測(cè)4 種糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，收集各組細(xì)胞，每孔加100～ 150 μL RIPA 裂解液充分裂解細(xì)胞，BCA法蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，與4×SDS 混合后于100℃煮沸10 min。根據(jù)定量結(jié)果調(diào)整各組加樣體積，10% SDS-PAGE 凝膠電泳(80～ 120 V，2 h)，電泳后濕轉(zhuǎn)法(200 mA，2 h)轉(zhuǎn)至PVDF膜，5% 脫脂奶粉室溫下封閉2 h，每次10 min，根據(jù)分子量大小裁剪PVDF 膜。TBST(1×)洗膜液洗膜3 次，每次10 min。一抗?jié)舛葹?∶1 000，4℃孵育過(guò)夜；洗膜同上；二抗?jié)舛葹?∶3 000，室溫孵育1 h；洗膜同上；應(yīng)用數(shù)碼凝膠圖形分析系統(tǒng)檢測(cè)GLUT1、HK2、PGAM1、LDHɑ的蛋白條帶。

6 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96 孔板中，每孔含細(xì)胞3×103個(gè)，每孔體積100 μL，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)樣孔。細(xì)胞貼壁后計(jì)為0 h，此后24 h、48 h、72 h、96 h 后吸出培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 10% CCK-8溶液，放入培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1 h。酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)的吸光值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

7 EdU 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6 孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜并且恢復(fù)到正常狀態(tài)后加入等體積濃度為20 μmol/L(2X) 的EdU 工作液，并在37℃、5% CO2條件下孵育2 h。去除培養(yǎng)液和EdU 工作液，加入4%多聚甲醛固定15 min。去除固定液，每孔用1 mL 洗滌液(含3% BSA 的PBS) 洗滌3 次，每次5 min。去除洗滌液，每孔用1 mL 通透液(含0.3% Triton X-100 的PBS)室溫孵育15 min。去除通透液，每孔用1 mL 洗滌液洗滌細(xì)胞2 次，每次5 min。按照試劑盒說(shuō)明書加入500 μL 的Click 反應(yīng)體系，在室溫下避光孵育30 min。吸除Click 反應(yīng)液，用洗滌液洗滌3 次，每次5 min。用PBS 按1∶1 000比例稀釋Hoechst 33342 (1000X)，吸除洗滌液后，每孔加1X Hoechst 溶液1 mL，室溫避光孵育10 min。吸除1X Hoechst 溶液，用洗滌液洗滌3 次，每次5 min，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

8 糖酵解水平檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)分別使用葡萄糖攝取、乳酸、丙酮酸、ATP 含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胃癌細(xì)胞的葡萄糖攝取率以及乳酸、丙酮酸、ATP 含量。實(shí)驗(yàn)按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行，待樣本制備完成后，使用全波譜酶標(biāo)儀根據(jù)相應(yīng)波長(zhǎng)測(cè)量吸光度，并進(jìn)行校正比較。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的兩兩比較采用Dunnet-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 siRNA 能夠有效降低胃癌細(xì)胞lncRNA CCAT2的表達(dá) 本研究首先利用siRNA 轉(zhuǎn)染BGC-823、HGC-27 胃癌細(xì)胞，qRT-PCR 結(jié)果證實(shí)兩條靶向lncRNA CCAT2 的siRNA 能夠顯著降低細(xì)胞中l(wèi)ncRNA CCAT2 的表達(dá)含量，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(BGC-823：F=178.910，P＜0.001；HGC-27：F=109.641，P＜0.01)。見圖1。

圖1 應(yīng) 用siRNA 敲 低lncRNA CCAT2 的 表 達(dá)(a P＜0.001,vs NC)。NC 為對(duì)照，siCCAT2-1 和siCCAT2-2 為靶向lncRNA CCAT2 的兩個(gè)小干擾RNAFig.1 Application of siRNA to knock down the expression of lncRNA CCAT2 (aP＜0.001,vs NC).NC is the control,siCCAT2-1 and siCCAT2-2 are two small interfering RNAs targeting lncRNA CCAT2

2 敲低lncRNA CCAT2 可抑制胃癌細(xì)胞的糖酵解水平 酶標(biāo)比色法檢測(cè)葡萄糖吸收量(BGC-823：F=41.573，P＜0.001；HGC-27：F=50.658，P＜0.001) 以 及ATP(BGC-823 ：F=47.775，P＜0.05；HGC-27 ：F=36.115，P＜0.001)、乳酸(BGC-823：F=161.566，P＜0.001；HGC-27：F=117.407，P＜0.001)、丙酮酸(BGC-823：F=38.644，P＜0.001；HGC-27：F=78.588，P＜0.01) 產(chǎn)量，結(jié)果表明4 項(xiàng)糖酵解相關(guān)指標(biāo)均明顯下降(P＜0.001，圖2)。采用Western blot 法檢測(cè)糖酵解相關(guān)的關(guān)鍵蛋白GLUT1、HK2 PGAM1、LDHα 的表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，這4 種糖酵解相關(guān)蛋白呈現(xiàn)明顯下調(diào)趨勢(shì)。見圖3。

圖2 敲低lncRNA CCAT2 后對(duì)胃癌細(xì)胞糖酵解水平的影響(aP＜0.001，bP＜0.01，vs NC)Fig.2 Effect of knockdown of lncRNA CCAT2 on the glycolysis level of gastric cancer cells (aP＜0.001,bP＜0.01,vs NC)

圖3 Western blot 檢測(cè)4 種糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)水平(GLUT1：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1；HK2：己糖激酶2；PGAM1：磷酸甘油酸變位酶1；LDHɑ：乳酸脫氫酶ɑ；β-actin 為內(nèi)參蛋白。aP＜0.001，bP＜0.01，vs NC)Fig.3 Expression levels of 4 glycolysis-related proteins were detected by Western blot (GLUT1:glucose transporter 1;HK2:hexokinase 2;PGAM1:phosphoglycerate mutase 1;LDHɑ:lactate dehydrogenase alpha;β -actin is the internal reference protein.aP＜0.001,bP＜0.01,vs NC)

3 敲低lncRNA CCAT2 可抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力 使用CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)胃癌細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果顯示敲低lncRNA CCAT2 可抑制胃癌細(xì)胞的增殖水平(BGC-823：F=15.988，P=0.004；HGC-27：F=32.884，P=0.001)。EdU 法檢測(cè)胃癌細(xì)胞增殖能力，與對(duì)照組相比，敲低lncRNA CCAT2 后胃癌細(xì)胞的增殖能力明顯下降(BGC-823：F=25.526，P=0.001；HGC-27：F=24.621，P=0.001)。見圖4。

圖4 敲低lncRNA CCAT2 后對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響(aP＜0.001，bP＜0.01，cP＜0.05，vs NC)A、B：CCK-8 實(shí)驗(yàn)；C：EdU 實(shí)驗(yàn)中的相對(duì)增殖細(xì)胞數(shù)；D：EdU 實(shí)驗(yàn)(藍(lán)色代表總的細(xì)胞數(shù)，紅色代表增殖水平的細(xì)胞數(shù))Fig.4 Effect of knockdown of lncRNA CCAT2 on the proliferation of gastric cancer cells (aP＜0.001,bP＜0.01,cP＜0.05,vs NC)A,B:CCK-8 experiment;C:the relative number of proliferating cells in the EdU experiment;D:EdU experiment (blue represents the total number of cells,red represents the number of proliferating cells)

討 論

近年來(lái)，lncRNA 在胃癌中的作用機(jī)制已有較多研究報(bào)道。陳大欣等[10]報(bào)道lncRNA ATB 能夠顯著降低胃癌細(xì)胞攝取葡萄糖和乳酸產(chǎn)生的含量，從而影響胃癌的惡性生物學(xué)行為。Wang 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HULC 可以通過(guò)LDHA 和PKM2促進(jìn)肝癌細(xì)胞的糖酵解水平。Liao 等[12]研究表明lncRNA EPB41L4A-AS1 通過(guò)調(diào)控HDAC2 的核糖移位來(lái)發(fā)揮代謝重編程作用，影響癌細(xì)胞的糖酵解水平。Hu 等[13]研究發(fā)現(xiàn)敲低lncRNA HOTAIR通過(guò)miR-130a-3p/HIF-1α 信號(hào)軸抑制肝癌細(xì)胞的糖酵解能力。Guo 等[14]發(fā)現(xiàn)lncRNA-GC1 可以通過(guò)外泌體的形式參與胃癌的惡性行為，可以作為早期胃癌的診斷標(biāo)志物?？梢姡琹ncRNA 在胃癌的診斷、治療以及惡性生物學(xué)行為中起到重要作用，探明其在胃癌中的作用機(jī)制可以為胃癌的診療提供理論研究基礎(chǔ)。

lncRNA CCAT2 是位于人類染色體8q24.21 區(qū)域的非編碼RNA，最初發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中過(guò)度表達(dá)，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為[6,15]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，lncRNA CCAT2在食管癌、骨腫瘤等其他實(shí)體瘤中也呈現(xiàn)高表達(dá)，并且與腫瘤的增殖、侵襲，放化療抵抗等存在一定關(guān)系[16-17]。lncRNA CCAT2 在胃癌中的作用也被逐漸認(rèn)識(shí)。既往研究表明，lncRNA CCAT2的表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后明顯相關(guān)，但具體調(diào)控機(jī)制尚不明確[18-19]。癌細(xì)胞的糖代謝功能較特殊，即使在氧氣充足的情況下仍然存在十分活躍的糖酵解，甚至是其主要的供能來(lái)源[20-22]。因此，我們推測(cè)lncRNA CCAT2 可能與胃癌細(xì)胞的糖代謝重編程存在機(jī)制關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，敲低lncRNA CCAT2 直接導(dǎo)致胃癌細(xì)胞糖酵解相關(guān)行為及代謝物水平下降，GLUT1 等4 種糖酵解相關(guān)蛋白的表達(dá)也隨著lncRNA CCAT2 的降低而下調(diào)。GLUT1 是糖代謝的關(guān)鍵蛋白，與葡萄糖具有高度的親和性，可以促進(jìn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，在缺氧條件呈現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢(shì)，促進(jìn)了癌細(xì)胞的糖酵解能力[23]。PGAM1 是糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶，可將3-磷酸甘油酸催化生成2-磷酸甘油酸。近年來(lái)研究顯示，PGAM1 參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，其在乳腺癌、胰腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)[24]。體外實(shí)驗(yàn)表明，敲低lncRNA CCAT2 可顯著削弱胃癌細(xì)胞增殖能力和糖酵解水平。以上實(shí)驗(yàn)提示，lncRNA CCAT2 可能通過(guò)調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞糖代謝重編程維持其惡性增殖能力。

綜上所述，本研究揭示了lncRNA CCAT2與胃癌糖代謝之間的調(diào)控關(guān)系，敲低lncRNA CCAT2 可抑制胃癌細(xì)胞糖酵解能力以及體外增殖速度。實(shí)驗(yàn)詮釋了lncRNA CCAT2 促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展的潛在機(jī)制，為進(jìn)一步豐富lncRNA 介導(dǎo)糖代謝重編程的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)以及尋找胃癌治療的潛在靶點(diǎn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者不存在利益沖突。