6例透明帶基因突變患者IVF-ET臨床特征及助孕結局分析

李丹，朱麗霞，汪萌，李舟，席青松，靳鐳

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院生殖醫學中心，武漢 430000)

透明帶(zona pellucida，ZP)是由卵母細胞分泌的、包裹在卵母細胞表面的一層糖蛋白結構，ZP由ZP1、ZP2、ZP3和ZP4糖蛋白組成，并在受精過程中發揮著重要的作用。ZP基因突變會改變ZP蛋白的結構和功能、引發空卵泡綜合征(empty follicle syndrome，EFS)，從而影響受精過程，最終導致女性不孕。本文分析了6例EFS或ZP異常患者接受輔助生殖技術助孕治療后的臨床特征及助孕結局，為女性不孕基因診斷和進一步的臨床診療提供了新的依據。

一、資料與方法

1.研究對象：選取2015年1月至2020年3月于本院生殖醫學中心行IVF-ET助孕治療的6例EFS或ZP異常患者為研究對象。

納入標準：(1)年齡25～35歲；(2)因EFS或ZP異常而診斷為不孕癥。排除標準：單純因HCG因素導致的EFS患者。

行IVF前患者配偶均進行了男性精液常規檢測且參數正常。該研究得到同濟醫院倫理監督委員會的批準。

2.樣本采集及DNA提取：采集患者及家系成員外周靜脈血2 ml，并用Cwbio Gel Extraction Kit試劑盒(北京康為)提取外周血基因組DNA，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

3.全外顯子組測序及數據分析：將基因組DNA打斷成隨機碎片，純化后進行全基因組外顯子捕獲，采用Agilent SureSelect Human All Exon V4試劑盒(Agilent，美國)進行外顯子組富集，使用HiSeq2000測序儀(Illumina，美國)進行高通量測序，并使用Illumina base-calling軟件1.7處理原始圖像文件，最后結合NCBI CCDS(www. ncbi. nlm. nih. gov/CCDS/)、RefSeq(www. ncbi. nlm. nih. gov/refseq/)、Ensembl(www. ensembl. org)、Encode(www. encodeproject. org)、dbSNP 135(www. ncbi. nlm. nih. gov/SNP/)、HapMap(www. ncbi. nlm. nih. gov/hapmap/)、1000 Genome project(www. internationalgenome. org)等數據庫收錄的致病基因和變異的信息對檢出的變異進行分析。

4.促排卵方案：采用GnRH激動劑方案、拮抗劑方案或者高孕激素狀態下促排卵(PPOS)方案進行控制性促排卵。當有3個卵泡直徑≥18 mm時，當天22：00 pm肌肉注射HCG(艾澤，默克，美國)10 000 U，36 h后在陰道超聲監測下穿刺取卵。

二、結果

1.患者的基本情況：納入本研究的6例患者來自5個獨立的家庭且均為原發不孕。大多數患者的卵母細胞由于ZP缺失而退化，導致在體外受精中難以獲取卵母細胞，臨床表現為EFS、無透明帶卵母細胞(ZFO)、薄透明帶卵母細胞(ZTO)(表1)。

表1 患者的基本情況

2.ZP基因突變位點：全外顯子組測序發現，6例患者染色體核型均為46，XX，其中，病例1與病例2是來自同一家庭的1對姊妹，經基因檢測證實均為ZP1基因復合雜合突變[1]；病例3與病例6為ZP2基因復合雜合突變；病例4與病例5為ZP3基因雜合突變。6例患者ZP基因突變位置及位點見表2。

表2 患者ZP基因突變位點

3.促排卵方案及助孕結局：病例1采用促性腺激素釋放激素(GnRH)激動劑方案促排卵1個周期，共獲得5枚結構不清晰的卵冠丘復合物(OCCs)，經用透明質酸酶去除周圍的卵丘細胞后未發現卵母細胞。

病例2采用GnRH激動劑方案或拮抗劑方案促排卵2個周期，均未成功獲得OCCs。病例1和病例2均表現為EFS，均未移植、取消周期。

病例3采用拮抗劑或PPOS方案共促排卵4個周期。第1個周期行常規IVF，共獲OCCs 5枚，MⅡ卵5枚(2個無ZP，3個ZP極薄)，均未受精；其余3個周期改行ICSI，共獲OCCs 13枚，MⅡ卵9枚(ZP薄且卵周間隙大)，6枚卵母細胞正常受精，胚胎培養至第3天共冷凍6枚2級胚胎(細胞數6～10，碎片≤10%，卵裂球相對均勻)，在隨后的4個冷凍復蘇胚胎移植周期中均未能成功妊娠[1]。

病例4采用GnRH激動劑或拮抗劑方案促排卵2個周期，共獲得8枚OCCs，其中7個為空卵丘，1個為MⅡ卵(無ZP)，體積約為正常卵母細胞大小的1/2～1/3，行ICSI后未能正常受精，取消周期[2]。

病例5采用GnRH激動劑促排卵2個周期，第1個周期僅獲得2枚空卵丘，第2個周期獲得3枚卵母細胞均為ZP極薄且形態異常。經體外培養后無極體排出，取消周期。

病例6采用GnRH激動劑方案促排卵2個周期，共獲得8枚OCCs。透明質酸酶處理OCCs后其中4個為空卵丘，無卵母細胞或卵母細胞退化；MⅡ卵4枚(3個ZP極薄，1個無ZP)，行ICSI后2個卵母細胞正常受精，培養至第6天形成質量較差的囊胚(6CC)予以冷凍保存，在隨后的冷凍復蘇周期移植后未能成功妊娠。全部病例的促排卵情況及助孕結局見表3。

表3 患者的促排卵情況及助孕結局

三、討論

ZP是包裹在卵母細胞以及植入前胚胎表面的多層糖蛋白。ZP在卵母細胞的發育，精卵識別、結合和穿透，促進頂體反應，阻止多精子受精，保護著床前胚胎等方面發揮著重要的作用[3]。人類的ZP蛋白包括ZP1、ZP2、ZP3和ZP4[4]，4種ZP蛋白間通過非共價鍵相互結合[5]，小鼠的ZP與人的高度同源且結構相似，但僅由ZP1、ZP2和ZP3組成。ZP1蛋白貫穿連接ZP2和ZP3蛋白聚合物形成的花環體[6]，形成完整的ZP。ZP蛋白在卵細胞生長過程中由ZP基因編碼產生，ZP基因突變可能引起ZP蛋白的結構和功能改變，從而影響ZP蛋白間的相互作用及其纖維網絡的形成，最終可能會影響受精并引起女性不孕。

多項動物研究證實，ZP基因突變會引起卵母細胞形態異常，繼而影響生育能力。ZP1基因敲除小鼠表現為ZP結構異常(ZP薄、松散)，其生育力僅為正常小鼠的一半[7]。缺乏ZP2的小鼠表現為ZTO且缺乏排卵前卵泡，當小鼠繁殖期時，卵巢中竇卵泡數量顯著減少，排卵減少并且不能形成兩細胞期胚胎[8]，而且對缺乏ZP2的雌性小鼠的卵母細胞行IVF時，形成的囊胚不能正常發育。缺乏ZP3的小鼠雖然其它ZP蛋白均可正常表達，但不能形成ZP，幾乎不能排卵且缺乏生育能力[9]。與ZP2突變小鼠一樣，缺乏ZP3的小鼠的體外受精卵最多只能發育到囊胚期。ZP基因突變小鼠改變了ZP蛋白的結構和功能，從而影響ZP的組成和組裝，進而影響受精，導致生育障礙。

Huang等[10]首次發現了ZP1基因上的純合移碼突變c.1169_1176delTTT TCCCA(p.Ile390Thrfs*16)，該突變使ZP1基因的終止密碼子提前出現，導致蛋白質鏈后1/3整體丟失，全部卵母細胞表現為ZP缺失，患者失去生育力。Dai等[11]在5例因EFS導致的原發不孕的患者中發現了6個新的ZP1突變，且IVF周期中均未獲得卵母細胞或者僅見少量的胞漿碎片。Sun等[12]在2例因EFS導致的不孕姐妹中發現了ZP1基因的復合雜合突變(NM_207341.3：c.170_174del，p.G57Dfs*9 和c.1169_1176del，p.I390Tfs*16)，她們的卵母細胞均表現為退化，這與本研究中的病例1和病例2臨床表型相似，但本研究鑒定出的ZP1基因的復合雜合突變為c.507delC，p.His170fs和c.239G>A，p.Cys80Tyr。已發現的這些ZP1基因的復合雜合突變可能導致ZP1蛋白缺失，通過阻斷了ZP1和ZP2、ZP3之間的相互作用，影響卵母細胞ZP的形成，從而導致卵母細胞變性或卵母細胞在卵泡穿刺過程中脆弱性增加，最終導致EFS和女性不孕[1，12]。

Chen等[13]報道了一個ZP3的雜合錯義突變(c.400G>A)，該突變阻礙了ZP2和ZP3之間的相互作用，破壞了ZP蛋白的組裝，導致卵母細胞變性和EFS。Cao等[14]也報道了相同的ZP3雜合突變(c.400G>A)，p.Ala134Thr突變體影響了ZP3和ZP2之間的相互作用導致ZP形成障礙，ZP3雜合突變患者在其IVF周期中表現為ZFO或完全無卵母細胞。Zhou等[15]報道了一個ZP3雜合突變(c.763C>G)，突變的ZP3蛋白可能與野生型的ZP3蛋白競爭與其他ZP蛋白的結合，影響ZP的形成從而導致ZFO或原發不孕。本研究發現了2例ZP3雜合突變(c.518C>G，p.Ser173Cys；c.400 G>T，p.Ala 134Ser)患者，她們的卵母細胞表現為相似的EFS或者無ZP。ZP3雜合突變降低了ZP3和ZP2之間的相互作用，影響ZP纖維網絡的形成，導致女性不孕[2]。

Liu等[16]首次描述了1例同時具有ZP2雜合錯義突變(c.2092C>T)和ZP3 雜合移碼突變(c.1045_1046insT)的患者資料，該患者第1個IVF周期，全部卵母細胞因無ZP而受精失敗；第2個IVF周期卵母細胞ZP較薄，接受ICSI治療后成功活產。Dai等[17]研究發現，在2例無血緣關系的女性中發現了2種ZP2的純合子突變(c.1695-2A>G，c.1691_1694dup p.C566Wfs*5)，所有攜帶突變的卵母細胞被一層薄的ZP所包圍，這2例患者在常規IVF中全部受精失敗，ICSI后分別受精率為100%和80%，1例患者于凍融周期移植2個囊胚后單胎妊娠并成功活產，另一例患者新鮮胚胎移植1個第5天囊胚，但植入失敗。在本研究中，我們發現病例3和病例6均為ZP2的復合雜合突變(c.860_861delTG，p.Val287fs和c.1924C>T，p.Arg642Ter；c.1695-2A>G和c.2407C>T，p.Arg642Ter)，病例3表現為大部分卵母細胞ZP較薄且卵周間隙大，少部分無ZP或卵母細胞退化，病例6則表現為大部分卵母細胞退化，少部分為ZP缺失或ZP極薄。經多次凍融周期胚胎移植病例3和病例6均未成功妊娠。

本研究中的6例患者配偶精液檢查正常，首次體外受精均采用常規IVF，病例1、2、4、5、6第1個IVF周期均未獲得卵母細胞或者卵母細胞退化，只有病例3第1個IVF周期獲得5枚無ZP或者ZP極薄的卵母細胞，且均受精失敗，這與之前的報道一致[16-17]。突變的ZP2蛋白可能不會分泌到卵母細胞的表面，只能形成一個薄而有缺陷的ZP。ZP2介導了精子與ZP的結合，ZP缺陷的卵母細胞會導致與精子結合失敗，即精子無法成功穿透ZP，從而導致體外受精失敗和女性不孕[17-18]。根據之前的報道和我們的研究發現，病例3改做ICSI可以幫助患者改善受精結局，建議此類患者改變授精方式。對于具有空卵泡、ZP缺失或者ZP較薄等情況的患者，建議篩查ZP基因是否有突變。基于之前報道ZP基因突變引起的ZP變薄有成功活產案例，在與患者溝通并告知IVF的妊娠率較低的情況下可以嘗試ICSI。而如果患者促排卵幾次均無法獲得卵母細胞，且表現為EFS且ZP基因檢測異常，建議患者早日更改助孕策略，行供卵體外受精。

總之，本研究發現，ZP基因突變引起的EFS或ZP的異常會嚴重影響患者的助孕結局，建議用全外顯子組測序篩查ZP基因是否突變。本研究拓寬了女性不孕癥的遺傳原因，為女性不孕的基因診斷和進一步的臨床診療提供了新的依據。