胚胎染色體異常與女性年齡和FMR1基因相關性分析

崔亞美，羅嵐蓉，李長東，王程榮，陳素文*

(首都醫科大學附屬北京婦產醫院 北京婦幼保健院 1.計劃生育科；2.科研處，北京 100026)

稽留流產的發生率越來越高，給家庭和社會帶來了沉重負擔。稽留流產的病因很多，包括父母年齡、遺傳、激素、免疫和環境因素等[1-2]，其中夫妻染色體重組和異常胚胎基因型或核型的遺傳因素，可能是流產的主要原因，而異常胚胎核型是稽留流產的主要病因。但是導致胚胎染色體異常的原因仍需我們進一步研究。1991年荷蘭科學家Verkerk等[3]發現脆性X智力障礙1號基因(FMR1)，位于染色體Xq27.3，該基因又稱家族性智力低下基因，它的5’端非編碼區有一個不穩定的CGG三核苷酸串聯重復序列。CGG重復序列具有多態性，美國醫學遺傳學和基因組學學會將CGG重復序列分為四大類[4]：CGG重復數在5～44之間定義為“正常型”；45～54之為“中間型”或者“灰區”；55～199之間為“前突變”；200以上為“全突變”。還有學者提出了高正常等位基因(重復數在35～44之間)[5]。FMRl基因已被證實是導致原發卵巢功能不足和卵巢儲備功能減退最重要的單基因因素，其突變將導致脆性X相關的原發性卵巢功能不全[6]，但其是否與胚胎染色體異常鮮有報道。本研究擬對首都醫科大學附屬北京婦產醫院計劃生育科稽留流產進行刮宮的女性進行調查，檢測胚胎染色體、夫妻雙方染色體核型，檢測女性FMR1基因(CGG序列表示)，旨在了解胚胎染色體異常的發生率及其相關影響因素。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2017—2020年在首都醫科大學附屬北京婦產醫院計劃生育科就診的稽留流產要求刮宮手術的女性患者的臨床資料。胚胎染色體均進行檢測。

納入標準：(1)年齡≥14歲；(2)稽留流產女性胎芽長<2.0 cm；(3)進行胚胎染色體檢測；(4)當地常住居民。排除標準：有刮宮手術禁忌癥。

共收集了751名病例資料，剔除各項信息填寫不完整的8名，本研究共納入了743名研究對象。本項目已經過北京婦產醫院倫理委員會批準，研究開始前所有女性均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.資料收集：研究人員為我院具有碩士或以上學歷的住院醫師或主治醫師。數據錄入時按自制的Excel表格錄入患者以下信息：包括人口學因素、生活行為因素等信息。登記患者的一般情況，包括年齡、孕產次、人工流產次數、稽留流產次數。所有數據導入SPSS 22.0軟件。

2.基因檢測方法：抽取研究對象外周靜脈血2 ml，以Magen全血DNA提取試劑盒(Magen，美國)提取基因組DNA，利用脆性X-FMR1基因Amplide X檢測技術(Asuragen，美國)進行CGG重復序列數檢測。因為檢測了女性的兩條染色體上的基因，所以結果包含CGG1和CGG2兩種形式。

3.染色體檢測：由奧美基因生物科技有限公司利用熒光原位雜交(FISH)技術對胚胎、夫妻雙方染色體數目進行檢測。

4. 分組：根據染色體檢查結果，將來我院就診的上述患者分為胚胎染色體正常組(n=334例)和胚胎染色體異常組(n=409例)，比較兩組患者的基本資料及染色體檢測結果。

三、統計方法

結 果

一、患者一般資料

本研究共納入743名稽留流產患者。檢測743名患者的胚胎染色體、部分夫妻雙方染色體及女性FMR1基因的CGG拷貝數(結果以CGG1和CGG2形式表達)。檢測結果顯示，胚胎染色體異常的患者有409名，占54.50%(409/743)，胚胎染色體異常以染色體三體為主，占82.15%(336/409)。

與胚胎染色體正常組患者相比，胚胎染色體異常組患者的年齡更大，孕、產次更多，FMR1基因CGG2序列更小，差異均有統計學意義(P<0.05)；而FMR1基因CGG1序列在兩組間無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的基本情況比較(-±s)

二、易發生胚胎染色體異常的女性臨界年齡

以不同稽留流產女性年齡為界，將患者進行細化分組，比較各個年齡界點兩組患者的胚胎染色體異常發生率。結果顯示，除30歲界點(P>0.05)外，其余年齡界點兩組患者的胚胎染色體異常發生率均有顯著性差異(P<0.05)，提示32歲以后為易發胚胎染色體異常的臨界年齡(表2)。

表2 女性不同年齡界點的胚胎染色體異常與胚胎染色體正常的對比情況(n)

三、胚胎染色體異常與男女雙方染色體異常情況分析

743名患者中，部分患者夫妻雙方已在外院進行了染色體檢測，但未提供數據。其中，724名女性及689名男性在我院進行了染色體檢測，兩組間女方染色體異常與男方染色體異常差異均無統計學意義(P>0.05)(表3)。

表3 胚胎染色體與男女雙方染色體的情況分析(n)

四、胚胎染色體異常的影響因素分析

以胚胎染色體結果(胚胎染色體異常)為因變量，將稽留流產女性年齡和FMR1基因CGG2拷貝數進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示：隨著年齡的增長，胚胎染色體異常發生率增加(β=0.04，P<0.05)；隨著FMR1基因CGG2拷貝數增加，胚胎染色體異常發生率降低(β=-0.08，P<0.05)(表4)。

表4 胚胎染色體異常多因素回歸分析

討 論

染色體異常與流產的關系已有諸多研究，>38歲既往自然流產胚胎染色體異常患者的囊胚染色體異常率超過60%[7]，而有研究結果顯示胚胎染色體異常可能是高年齡患者稽留流產的重要原因[8]。有研究提示胚胎染色體異常是最常見的早期復發性流產的病因[9]，早期復發性流產患者胚胎染色體異常率較高，因此應作為常規篩查病因項目[10]。另有研究顯示染色體數目異常是胚胎停育的重要發病因素，其中常染色體三體最多見；胚胎停育絨毛染色體數目異常與孕婦年齡有關[11]。本文結果顯示，稽留流產患者中胚胎染色體異常占54.5%，胚胎染色體異常以染色體三體為主，占82.15%，與以往研究結果基本一致。所以我們建議稽留流產尤其是復發性流產的女性行胚胎染色體檢測。

既往研究表明，年齡是胚胎染色體異常的重要影響因素[12-15]。研究顯示，隨著孕婦年齡的增長，她們的卵巢功能隨之減退，胚胎染色體異常發生率增加，增加了胚胎非整倍體的發生率，進而增加了流產的幾率[12]。Soler等[14]的研究表明35歲為高齡孕婦的界定標準，女性在35歲之后受孕率開始下降，流產率開始上升。另外，對于≥35歲患者，高齡是患者胚胎染色體核型異常的主要高危因素[15]。超過35歲者生育比小于35歲者可能承擔高出25%左右的染色體異常風險[8]。本研究對入組的患者進行年齡分組對比，找出胚胎染色體異常的臨界女性年齡。我們以35歲為中心，從32歲到38歲每隔2歲進行分組，研究結果顯示，隨著年齡的增長胚胎染色體異常的發生率增加，且32歲為胚胎染色體異常的臨界年齡，早于之前研究中提到的35歲。研究顯示高齡是引起復發性流產胚胎染色體異常的高危因素[16-17]，而且高齡是胚胎染色體非整倍性的誘發因素[18]。染色體數目異常是導致胚胎早期自然流產最主要的原因，非整倍體尤其是常染色體三體是最常見的異常核型，且隨著孕婦年齡的增加染色體數目異常的風險顯著升高[19]。所以為了避免胚胎染色體異常導致的稽留流產，女性要盡早生育。本研究僅對胚胎染色體異常的臨界年齡進行了分析，我們以后會進一步對胚胎停育染色體數目異常與年齡的關系進行進一步分析。

雙親染色體異常是絨毛染色體異常的高風險因素[20]。女方染色體多態，尤其是1號、9號、16號染色體異染色質增加會導致IVF助孕患者異常受精比例增加以及種植率降低[21]。inv(9)有增加可能影響胚胎種植，導致復發性流產風險增加[22]。但是我們的研究顯示胚胎染色體異常與雙親的染色體異常無相關性，也可能是夫妻雙方的染色體為正常變異，排除其他原因后仍可以繼續妊娠，不會導致胚胎染色體異常。由此我們計劃進一步分析夫妻雙方染色體的具體核型。

諸多研究表明，隨著FMR1基因CGG重復次數增高自然流產或復發性流產的風險增加，例如：預測FMR1基因的(CGG)n可能與復發性流產有關[23-24]，反復生育失敗婦女的FMR1基因前突變攜帶者發生風險較高[25]，FMR1基因CGG重復序列前突變與不明原因早期自然流產可能存在相關性[26]，FMR1基因的擴增等位基因與原因不明的反復流產有關[27]等等。以上研究均提示胚胎染色體異常與FMR1基因的CGG拷貝數增加有相關性。但本文研究結果顯示隨著FMR1基因CGG2拷貝數增加，胚胎染色體異常發生率降低，與上述研究結果相反，可能是由于我們大部分病人的FMR1基因CGG重復序列均為正常型，正常型的FMR1基因CGG重復序列與胚胎染色體異常無相關性。但我們需進一步擴大樣本量進一步證實，同時胚胎染色體異常與FMR1基因是否有相關性仍需我們進一步研究。另外，有研究顯示有意義的拷貝數變異及其包含的流產相關候選基因將為進一步揭示自然流產原因提供研究方向[28]。

總之，本文研究結果表明胚胎染色體異常與女性年齡大有關，與我們前期的稽留流產與女性高齡研究結果一致[29]。但是胚胎染色體異常與雙親染色體無相關性，這個結果引起我們深思，或許正常的染色體變異不會引起胚胎染色體異常，但是我們的結果中胚胎染色體異常的夫妻雙方染色體異常比例也很低，這可能提示現在有其它的影響因素把這個遺傳因素給掩蓋了，到底是環境、壓力還是其它的因素會導致胚胎染色體異常，這個問題需要亟待解決。這為我們的進一步研究方向提供了思路，進而為有生育需求的家庭提供方向和指導性建議。