歸術益坤方對多囊卵巢綜合征模型大鼠卵巢組織及SIRT1-FOXO信號通路相關蛋白表達的影響

徐道立 林青 陳穎 李晶晶 佟慶

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種以內分泌紊亂為主、多種代謝異常導致的異質性臨床綜合征[1]，中國育齡期婦女中PCOS發病率達到6%～10%[2]，但其病因及發病機制目前仍未完全明確。SIRT1基因可通過調控多種下游蛋白表達及促進類固醇激素合成關鍵酶表達等多種途徑影響PCOS發病[3]。歸術益坤方是國醫大師柴嵩巖治療PCOS的經驗方，主要以補腎健脾、養血通利為法，并以“二陽致病”理論為指導，運用補肺啟腎之法，從而緩解脾腎不足、痰濕結聚的病理狀態，促進卵巢功能恢復及月經來復。前期研究證實，歸術益坤方能顯著下調PCOS患者血清睪酮、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)及卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，FSH)水平，改善相關癥狀，提高妊娠率[4]。細胞實驗證實，歸術益坤方能通過調控P53/AMPK通路影響卵巢顆粒細胞自噬，改善PCOS發病[5]。本研究旨在通過建立大鼠PCOS模型，以炔雌醇環丙孕酮片作為陽性對照藥，探究歸術益坤方對PCOS大鼠卵巢形態學、血清學及SIRT-FOXO通路相關蛋白的影響，進一步明確歸術益坤方治療PCOS的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及實驗環境

SPF級健康雌性SD大鼠40只，4周齡，體質量(90±20)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。飼養于北京中醫醫院實驗動物中心，溫度(22±2)℃，相對濕度(70±2)%。動物實驗符合北京中醫醫院倫理委員會相關規定。

1.2 實驗藥物

歸術益坤方組成：菟絲子15 g、白術12 g、當歸10 g、北沙參10 g、生麥芽10 g、茜草6 g、浙貝母15 g、蛇床子3 g。飲片購于北京中醫藥大學東方醫院草藥房。購買原藥50劑，所有原藥加10倍量水煎煮，共煎2次，每次1小時，合并濾液后濃縮，60℃減壓干燥后得浸膏986 g(得膏率27.7%)，分瓶灌裝密封后4℃冰箱冷藏保存備用。炔雌醇環丙孕酮片(拜耳醫藥保健有限公司，批號：20190630)購自北京中醫藥大學東方醫院西藥房。

1.3 主要試劑與儀器

丙酸睪酮注射液(寧波第二激素廠，批號20180624)，性激素Elisa試劑盒(Solarbio公司，批號20191123)，蛋白提取液(MDL公司，貨號MDL91201)，蛋白酶抑制劑(MDL公司，貨號MD912893)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(MDL公司，貨號MD913053)，SDS-PAGE預制膠套裝試劑盒(MDL公司，貨號MD911919)，蛋白上樣緩沖液(MDL公司，貨號MD6619)，封閉液(MDL公司，貨號MD912056)，麗春紅蛋白染液(MDL公司，貨號MD6622)，抗肌動蛋白抗體(Anti-Actin)(MDL公司，貨號MD6553)，兔抗PPAR-γ抗體(abcam公司，貨號ab209350)，兔抗PPARα抗體(abcam公司，貨號ab245209)，兔抗FOXO1抗體(Cell Singaling公司，貨號2880S)，兔抗FOXO3a抗體(Cell Singaling公司，貨號2497S)，兔抗SIRT1抗體(Cell Singaling公司，貨號9475S)，羊抗兔IgG-HRP(江蘇凱基生物，批號20190731)。

電子天平(德國Sartorius公司，型號Cubis?MSA224S-000-DA)，脫色搖床(海門其林貝爾儀器制造公司，型號TS-100)，旋渦混勻器(海門麒麟醫用儀器廠，型號XW-80A)，電泳儀(北京百晶生物技術有限公司，型號BG-subMIDI)，低溫離心機(德國Sigma公司，型號3-30K)，SDS-PAGE電泳系統(美國BIO-Rad公司，型號Mini-PROTEAN?Tetra Cell with Mini Trans-Blot?Module And PowerPacTMUniversal Power Supply)，凝膠成像系統(美國UVP公司，型號GelDoc-It310)，ChemiDoc MP化學發光成像系統(美國BIO-Rad公司，型號170-8280)。

1.4 高雄激素PCOS大鼠模型建立

4周齡雌性SD大鼠40只，隨機取8只為空白組，喂食普通飼料；剩余32只給予高脂飼料。喂養的第4周起將32只高脂飼料飼養大鼠按1 mg/100 g肌注丙酸睪酮注射液(2 mL∶25 mg)，連續肌注14天。每日陰道涂片并濕片觀察陰道脫落細胞形態變化，每3日測量大鼠的體重并記錄。

造模成功標準：(1)動情周期消失；(2)大鼠卵巢組織形態學變化：肉眼觀察大鼠卵巢顏色蒼白，長徑增長，體積增大，卵巢表面可見數量較多透明囊泡。蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色光鏡下觀察卵巢出現數目較多的囊狀擴張卵泡，卵泡內結構不完整，顆粒細胞層數為1～2層或消失，不見放射冠和卵母細胞；(3)血清睪酮超過正常值；(4)模型組大鼠體重高于空白組20%以上。

實際造模過程中無大鼠死亡，全部40只大鼠均進入分組給藥環節。

1.5 分組及給藥

造模期間以普通飼料喂養，未肌注丙酸睪酮的8只大鼠為空白組。將32只造模大鼠采用隨機數字表法分為模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、陽性對照組，每組8只。

中藥高劑量組按人鼠1∶8比例給予歸術益坤方浸膏(1.8 g/100 g)，中藥低劑量組按人鼠1∶4比例給予歸術益坤方浸膏(0.9 g/100 g)，陽性對照組按人鼠等效比例給予炔雌醇環丙孕酮片溶液(0.03 mg/kg)。各組每日給藥量均用生理鹽水稀釋至2 mL，模型組及空白組給予每日2 mL生理鹽水灌胃。每日固定15∶00灌胃，給藥時間3周。

1.6 取材與指標觀察

各組于末次給藥后禁食12小時，水合氯醛腹腔注射麻醉后將大鼠仰臥固定，腹主動脈采血處死，血液注入生化(紅)采血管中，離心后取上層血清保存于-80℃冰箱待測。下延切口，暴露子宮及雙側輸卵管、卵巢，眼科剪取下雙側卵巢組織，分離清除表面輸卵管及脂肪組織，稱重，游標卡尺測量雙側卵巢長、寬、厚，左側卵巢置于10%甲醛中固定，右側卵巢凍存于液氮中備用。

1.6.1 卵巢形態學變化 (1)卵巢大體形態學比較：觀察卵巢形態學變化、稱重，計算橢圓形卵巢體積[體積(mm3)=0.52×長×寬×厚]。分別計算雙側卵巢體積后取平均值記錄。(2)卵巢的相對質量(mg/100 g體質量)：根據大鼠體質量和卵巢質量計算卵巢相對質量(臟器指數)，即卵巢質量∕(體質量×10-2)。計算雙側卵巢的相對質量后取平均值記錄。

1.6.2 ELISA法檢測血清性激素(LH、FSH、睪酮)水平變化 參考ELISA試劑盒操作流程：以標準物濃度、OD值為橫縱坐標，計算出標準曲線、回歸方程，計算樣品濃度，乘以稀釋倍數后即可得實際樣品濃度。

1.6.3 Western Blot法檢測各組大鼠卵巢組織中SIRT1、PPAR-α、PPAR-γ、FOXO1、FOXO3蛋白相對表達 卵巢組織研磨勻漿后提取總蛋白，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，蛋白上樣緩沖液將蛋白定量為5 mg/mL。制備SDS-PAGE凝膠，上樣，電泳。濕轉法65V轉膜2小時至PVDF膜上，置封閉液中封閉1小時。加入不同的一抗孵育：兔抗SIRT1抗體(1∶1 000)、兔抗PPAR-α抗體(1∶500)、兔抗PPAR-γ抗體(1∶500)、兔抗FOXO1抗體(1∶1 000)、兔抗FOXO3抗體(1∶1 000)。TBST緩沖液室溫下緩慢搖動洗滌三次，每次10分鐘。羊抗兔IgG二抗用TBST稀釋3 000倍，室溫、避光緩慢搖動作用1小時。洗膜后用ECL發光試劑盒顯色，化學發光成像系統成像。Image J軟件數字化分析。目標蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/內參(GAPDH)灰度值。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 各組PCOS大鼠卵巢體積變化

與空白組相比，模型組大鼠的卵巢體積顯著增大(P<0.01)，表明高雄激素PCOS大鼠模型建立成功。與模型組相比，陽性對照組、中藥高、低劑量組大鼠卵巢體積均顯著減小(P<0.01)。其中，中藥高劑量組卵巢體積顯著小于陽性對照組(P<0.05)和中藥低劑量組(P<0.05)，而陽性對照組卵巢體積顯著低于中藥低劑量組(P<0.05)。上述結果說明，中藥歸術益坤方和炔雌醇環丙孕酮片對PCOS大鼠模型均有治療作用，可顯著降低卵巢體積，并且高劑量歸術益坤方(1.8 g/100 g)效果顯著優于炔雌醇環丙孕酮片。見表1。

表1 各組PCOS大鼠單個卵巢體積比較

2.2 各組PCOS大鼠卵巢相對質量變化

造模后，模型組大鼠的卵巢相對質量顯著增大(P<0.01)。較之模型組，陽性對照組、中藥高、低劑量組大鼠卵巢相對質量均減少(P<0.01)。其中，陽性對照組和中藥高劑量組的卵巢相對質量均小于中藥低劑量組(P<0.05)，而陽性對照組與中藥高劑量組間無明顯差異(P>0.05)。上述結果說明，中藥歸術益坤方和炔雌醇環丙孕酮片均可顯著降低PCOS大鼠模型的卵巢相對質量，且歸術益坤方的治療效果與劑量有關。見表2。

表2 各組PCOS大鼠卵巢相對質量比較

2.3 各組PCOS大鼠血清LH、FSH比較

造模后，模型組大鼠血清LH/FSH比值明顯上升(P<0.01)，陽性對照組、中藥高、低劑量組血清LH/FSH比值均有降低(P<0.05)。其中，中藥高劑量組與陽性對照組比較無明顯差異(P>0.05)，中藥高劑量組與中藥低劑量組比較無明顯差異(P>0.05)，但陽性對照組LH/FSH比值低于中藥低劑量組(P<0.05)。上述結果說明，中西藥物均對改善PCOS大鼠血清LH/FSH比值有效，但差異不明顯，炔雌醇環丙孕酮片的治療效果優于低劑量中藥。見表3。

表3 各組PCOS大鼠血清LH/FSH比較

2.4 各組PCOS大鼠血清睪酮比較

造模后，模型組大鼠血清睪酮水平明顯上升(P<0.01)，各治療組血清睪酮水平較模型組均有改善(P<0.05)。其中，陽性對照組血清睪酮濃度顯著低于中藥高、低劑量組(均P<0.05)，中藥高劑量組與低劑量組療效比較無明顯差異(P>0.05)。這提示，炔雌醇環丙孕酮片對于改善高雄激素血癥的治療效果優于中藥歸術益坤方。見表4。

表4 各組PCOS大鼠血清睪酮比較

2.5各組PCOS大鼠卵巢組織SIRT-FOXO信號通路相關蛋白表達情況

造模后，模型組大鼠卵巢內SIRT-FOXO信號通路相關蛋白SIRT1、FOXO1、FOXO3、PPAR-α、 PPAR-γ表達均升高(P<0.01)。 與模型組比較，中藥高、 低劑量組上述蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，且中藥高劑量組SIRT1、FOXO1、FOXO3、PPAR-γ蛋白的降低顯著優于中藥低劑量組。與模型組比較，陽性對照組FOXO1、FOXO3、PPAR-γ蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)，但SIRT1、PPAR-γ蛋白表達水平升高(P<0.05)。炔雌醇環丙孕酮對SIRT1、FOXO1、FOXO3的治療效果優于低劑量中藥(P<0.05)，弱于高劑量中藥(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 各組PCOS大鼠卵巢組織SIRT-FOXO信號通路相關蛋白表達情況比較

圖1 各組PCOS大鼠卵巢組織SIRT-FOXO信號通路相關蛋白表達

3 討論

PCOS發生的主要病因是臟腑功能失調引起腎—天癸—沖任—胞宮軸調節紊亂，其中脾腎兩虛是發病根本，肝郁是重要環節，痰濕、瘀血內阻為主要的病理機制，病性屬本虛標實，多從腎、脾、肝論治[4]。柴嵩巖國醫大師致力于本病研究70余年，歸納出本病“二陽致病”理論[6]，并依據此理論自擬歸術益坤方。全方以菟絲子、白術為君，菟絲子補肝腎，益精髓，白術味苦甘，有補氣健脾、燥濕利水、止汗安胎的功效；當歸為臣藥，既可活血，又可補血，補中有動，行中有補；另以益母草等藥為佐使。歸術益坤方全方共奏補腎健脾、養血通利之功，獨創從肺、脾、腎三臟共同論治之法，達到標本兼治之效。

本研究團隊前期研究已證實，歸術益坤方可顯著上調P53基因的表達，下調AMPK基因的表達，通過調控P53/AMPK通路影響卵巢顆粒細胞自噬，從而干預PCOS發病，這為中藥干預PCOS的機制研究提供了新依據[5]。

本研究目標在于SIRT1-FOXO通路。SIRT1作為一種去乙酰化酶，主要影響多種蛋白的轉錄，從而調節下游因子和蛋白表達水平，并可通過多種機制調控細胞凋亡，影響疾病發生[7]。SIRT1可與多種底物相互作用，通過去乙酰化形式參與調控細胞凋亡、DNA損傷的修復、脂代謝等過程[3]。

PPAR-α、PPAR-γ是SIRT1的下游基因，其表達與SIRT1正相關，升高的PPAR水平可激活脂肪動員，調節脂類重新分布[8]，這提示SIRT1可通過PPAR通路影響脂肪累積，導致PCOS患者肥胖、性激素變化和胰島素抵抗等臨床癥狀[9]。氧化應激時，FOXO的乙酰化增強，FOXO活化通路中下游靶因子的活性，發生細胞凋亡[10]。在棕色脂肪組織中，SIRT1抑制Smad3和ATF4進而減少應激引起的細胞凋亡[11]。

前期研究的P53基因亦可與SIRT1共同發揮作用，調節FOXO家族多種蛋白活性，同時FOXO也可反向調控SIRT1的表達，發揮各自生理功能。FOXO家族在應激損傷，DNA修復和細胞凋亡中發揮重要作用[12]。FOXO屬于叉頭盒轉錄因子家族，在哺乳動物中包含FOXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6四個亞型，其中FOXO1最早被發現、研究[13]。而FOXO家族成員FOXO1已被證明在糖脂代謝、胰島素抵抗及氧化應激過程中發揮著至關重要的作用[14-15]。FOXO1可通過增加血循環中葡萄糖水平來調節肝臟、胰腺、下丘腦—垂體軸和脂肪組織的循環代謝和激素分泌[16-17]，FOXO1在糖異生過程中作用于葡萄糖-6-磷酸酶等關鍵酶升高血糖水平，并通過胰島素影響胰島β細胞的凋亡和糖尿病的發展[18]。另有研究發現，FOXO1的表達與PCOS患者體內C反應蛋白、白介素和腫瘤壞死因子α等慢性炎癥因子呈正相關，后者通過內分泌、旁分泌和自分泌機制降低組織細胞對胰島素的敏感性，從而引起胰島素抵抗，導致PCOS發病[19-20]。

本研究在前期研究的基礎上，進一步聚焦歸術益坤方對SIRT1-FOXO通路的影響，以期進一步明確中藥治療PCOS的作用機制。結果顯示，經高脂飼料喂養聯合丙酸睪酮造模后，模型組大鼠卵巢體積、卵巢相對質量、血清LH/FSH比值、血清睪酮水平均有明顯提升，卵巢組織SIRT1-FOXO通路各相關蛋白表達均升高。經歸術益坤方干預后，卵巢體積、質量、血清學指標均有顯著改善，該通路相關蛋白表達也出現下調。其中部分結果中藥高劑量組優于中藥低劑量組，說明藥物劑量對療效存在影響。同時，陽性對照藥物炔雌醇環丙孕酮片對卵巢形態學、血清學指標均有改善，其中對血清LH/FSH比值、血清睪酮水平的療效明顯優于歸術益坤方，且對FOXO1、FOXO3、PPAR-γ蛋白亦有下調作用。以上結果證明，歸術益坤方可調控SIRT1-FOXO通路上相關基因表達，減輕PCOS大鼠卵巢增大、血清學改變等癥狀。但炔雌醇環丙孕酮并未影響PPAR-α、SIRT1蛋白表達，卻能顯著改善激素水平，尤其是降低血清睪酮，這提示SIRT1仍有其他下游基因，且除本通路外仍有其他可能的途徑影響PCOS的發病，值得進一步探索。