退熱六法對脂多糖致熱兔toll樣受體4/核轉錄因子-κB及炎癥因子的影響

焦誼 劉志鳳 于天源 張英琦 劉迪 王厚融 徐亞靜 官乾

發熱作為兒科常見的癥狀之一，發生率為25.7%，每人每年約0.8次[1]。長期發熱或體溫過高則會損害機體調節功能，使病情惡化。小兒推拿退熱具有安全性和有效性[2]，其中以開天門[3]138、推坎宮[3]138、揉太陽[3]138-139、揉耳后高骨[3]151、清天河水[4]、推脊[5]手法最為常用，現有小兒推拿退熱研究不深入，受到社會質疑。故選取脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)模型模擬臨床細菌性發熱，LPS作為toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)公認的配體，能刺激機體產生炎癥反應，核轉錄因子-κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)參與機體免疫調節、炎癥反應、感染、細胞周期調控、細胞分化及凋亡等[6]，發熱過程以炎癥介質如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)最為重要，故以退熱六法為例，設計實驗進行深入研究。

1 材料及方法

1.1 實驗動物

清潔級2月齡新西蘭幼兔24只，體質量(2000±200)g，肛溫(39.00±0.50)℃，雌雄各半，購自北京隆安實驗動物養殖中心[合格證號為SCXK(京)2019-0006]。飼養于北京中醫藥大學動物實驗室，溫度(25±0.5)℃，相對濕度(65±5)%，12小時/12小時明暗周期，自由飲食飲水。適應性飼養3天，排除肛溫波動大于0.4℃的新西蘭兔。實驗程序經北京中醫藥大學動物使用和管理委員會批準，符合動物福利與倫理原則。

1.2 儀器及試劑

主要試劑：大腸桿菌內毒素脂多糖(美國Sigma公司；批號：055：B5 L2880)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司；批號：PC0020)；TLR4抗體(批號：bs-20594R)、NF-κB p65抗體(批號：bs-0465R)、GAPDH抗體(批號：bsm-0978M)以上試劑均購自北京奧博森生物科技有限公司。

主要儀器： ChemiDoc MP成像儀(美國BIO-RAD公司)；MultiSkan3酶標儀(美國THERMO公司)；BL-420N(成都泰盟軟件有限公司)、動物五分類血細胞分析儀(優利特URIT-5160Vet)。

1.3 動物分組及模型制備

將24只新西蘭兔隨機分為正常組8只、模型組8只、推拿組8只。清醒狀態下，模型組和推拿組幼兔耳緣靜脈注射濃度為0.5 μg/mL LPS，注射量為1 mL/kg[7-8]，注射后1小時內肛溫上升超過0.6 ℃為造模成功，正常組不予處理。

1.4 干預方法

正常組和模型組正常飼養。推拿組：造模后1小時干預1次。(1)開天門：定位：兩眉骨內側中點至神庭穴(前正中線，額頂骨縫交界處)[9]，操作：用拇指自下而上交替直推200次，2分鐘[10]；(2)推坎宮：定位：精明穴(內眼角，上下眼瞼交界處)直上至絲竹空穴(眶上突外端)[9]，操作：用兩拇指橈側自眉心向眉梢做分推200次，2分鐘[10]；(3)揉太陽：定位：太陽穴(外眼角后上方顳窩中)[9]，操作：用兩拇指橈側推運200次，2分鐘[10]；(4)揉耳后高骨：定位：寰椎翼前緣直上方凹陷處[9]，操作：用兩拇指或中指端揉24次掐3下，2分鐘[10]；(5)推脊：定位：大椎穴(背中線上，第7頸椎與第1胸椎棘突間)至尾根[9]，操作：用食中二指自上而下直推300次，5分鐘[10]。(6)清天河水：定位：腕橫紋至肘橫紋[9]，操作：用食中指指面自腕推向肘，推500次，5分鐘[11]。操作要點：由推拿學科專業人員操作，且都為同一人干預，操作時蘸取與室溫相同的溫水。

1.5 取材及指標檢測

1.5.1 肛溫監測 采用BL-420N監測肛溫變化。肛溫探頭涂上適量石蠟油，插入肛門固定為5 cm，待穩定后讀數，作為幼兔的肛溫，之后每隔30分鐘記錄一次肛溫，連續監測6小時。體反應指數(total response index,TRI)：按梯形法計算造模后2小時、3小時、4小時、5小時、6小時的曲線下面積(TRI2-6)，橫坐標0.5小時為1 cm，縱坐標0.5 ℃為1 cm。

1.5.2 中性粒細胞比率檢測 于造模前、造模后1小時、造模后3小時(即推拿后2小時)耳緣靜脈采血，用EDTA抗凝管采取0.5 mL即可，抽取完畢后輕輕搖勻4～5次，避免凝血。在室溫保存2小時內檢測中性粒細胞比率(neutrophil granulocyte,NEU%)。

1.5.3 酶聯免疫吸附法檢測血清TNF-α、IL-1β含量 于造模后3小時(即推拿后2小時)耳緣靜脈采血1 mL，置于紅色真空采血管中，室內保存20分鐘內進行離心，4℃ 3000 rpm離心20分鐘，取上清置于EP管保存，按試劑盒方法測定血清中TNF-α、IL-1β含量。

1.5.4 蛋白免疫印跡法檢測肝、肺組織TLR4、NF-κB p65蛋白表達 于造模后3小時腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100g)，抽取腹主動脈血，取出適量大小肝臟、肺臟組織100 mg，將組織放于組織裂解液中研磨，每10分鐘震蕩1次，共震蕩4次，混合液4℃、12000 rpm 離心20分鐘，吸取上清。BCA蛋白試劑盒進行蛋白定量，加5×蛋白上樣緩沖液混勻，95℃變性5分鐘。配置8%分離膠和5%濃縮膠，上樣后穩定電泳濃縮膠60 V、分離膠80 V，冰上電轉100 V 70分鐘，10%脫脂奶粉封閉2小時，依據Maker裁膜，一抗(TLR4 1∶1000，NF-κB p65 1∶2000，GAPDH 1∶1000)室溫搖床孵育1小時后4℃冰箱過夜。洗膜3次，孵育二抗(羊抗兔IgG 1∶10000，羊抗小鼠 IgG 1∶10000)，顯影液均勻滴在膜上，成像儀顯影，Image Lab圖像分析軟件分析目的條帶，定量分析各蛋白條帶灰度值。

1.6 統計學分析

注：A:開天門；B：推坎宮；C：揉太陽；D：揉耳后高骨；E：推脊；F：清天河水

2 結果

2.1 各組幼兔肛溫變化比較

基礎肛溫：正常組基礎肛溫與模型組、推拿組相比，無顯著性差異(P>0.05)；造模后1小時(推拿前)：推拿組與模型組無顯著性差異(P>0.05)，推拿組和模型組肛溫顯著高于正常組(P<0.05)；造模后2小時、3小時、4小時(即推拿后1小時、2小時、3小時)：推拿組肛溫顯著低于模型組(P<0.05)；造模后5小時、6小時(即推拿后4小時、5小時)：推拿組肛溫與模型組無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖2。

表1 退熱六法對各組幼兔肛溫的影響

圖2 退熱六法對各組幼兔肛溫的影響

造模后3小時、4小時、5小時、6小時，推拿組體反應指數明顯低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 退熱六法對各組幼兔體反應指數的影響

2.2 各組幼兔中性粒細胞比率變化比較

造模后3小時，推拿組NEU%顯著低于模型組(P<0.05)；組內比較，模型組造模后1小時、3小時的 NEU%高于造模前(P<0.05)，推拿組只有造模后1小時的 NEU%高于造模前(P<0.05)；推拿組造模3小時 NEU%與造模前無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 退熱六法對各組幼兔外周血中性粒細胞比率表達的影響

2.3 退熱六法對發熱幼兔血清炎癥因子的影響

造模后3小時，模型組血清中TNF-α含量明顯高于正常組(P<0.05)，推拿組血清中TNF-α含量明顯低于模型組(P<0.05)；模型組血清中IL-1β含量高于正常組(P<0.05)，推拿組血清中IL-1β含量低于模型組(P<0.05)。見表 4。

表4 退熱六法對各組幼兔血清炎癥因子表達的影響

2.4 退熱六法對發熱幼兔肝、肺組織TLR4/NF-κB p65的影響

造模后3小時，推拿組和模型組肝、肺組織中TLR4、NF-κB p65表達高于正常組(P<0.05)；推拿組肝、肺組織中TLR4表達低于模型組(P<0.05)，推拿組和模型組NF-κB p65表達無明顯差異(P>0.05)。見圖5、6，表3、4。

表5 退熱六法對各組幼兔肝組織TLR4及NF-κB p65蛋白表達的影響

表6 退熱六法對各組幼兔肺組織TLR4及NF-κB p65蛋白表達的影響

圖3 退熱六法對各組幼兔肝組織TLR4/NF-κB p65表達的影響

圖4 退熱六法對各組幼兔肺組織TLR4/NF-κB p65表達的影響

3 討論

小兒推拿手法治療發熱有著獨特的優勢，較口服及靜脈給藥更能獲得家長的認可[12]，其療效及機制問題，是推拿學科關注的熱點之一，臨床上小兒推拿退熱的手法不統一，治療范疇及機制不明確，以致療效和安全性被質疑。魏理珍等[13]研究發現清天河水可能通過抑制下丘腦正調節介質前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)和環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)含量而降溫。臨床上推拿退熱效果顯著，推拿能下調發熱患兒外周血清TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子水平[14]。因此，本研究探討了推拿對炎癥性發熱的影響，結果提示推拿能明顯抑制發熱，抑制炎癥反應，下調中性粒細胞比率，可能是通過TLR4信號通路實現。

根據研究發現，耳緣靜脈注射0.5 μg/kg的LPS，造模成功率達83%，造模后1小時肛溫明顯升高，造模后3小時肛溫達最高峰，與基礎肛溫相比，約上升1.6℃，隨后肛溫逐漸下降，持續約6小時，與研究相符[8]。選取退熱六法作為干預方式，其中頭面四大手法屬于“和法”，可調節陰陽，天人相應，天河水倍受歷代醫者的推崇，均認為清天河水是“清法”的重要代表，在各種熱證下均可施用，脊椎占督脈近三分之二的循行部位，推脊對督脈氣機有調節作用。推拿后即刻便會出現降溫現象，降溫幅度最高達1℃。

發熱是體溫調節系統紊亂的表現，是反應炎癥性疾病的重要標志，眾所周知，TLR4介導的信號轉導參與了慢性和急性炎癥反應[15]，其中TLR4/NF-κB是炎癥調節的經典信號通路，參與了炎癥性發熱的體液機制。炎性細胞因子能影響免疫反應，并對各種組織或器官造成損傷[16]。TNF-α、IL-1β參與調節早期免疫反應[17]，是發熱的關鍵介質，其中肺臟、肝臟是失調炎癥反應的潛在目標。基因敲除TNF-α后注射LPS，發現小鼠體溫明顯升高，說明TNF-α參與了負反饋機制，限制了發熱的程度[18]，有研究表明注射TNF-α血清抗體能影響發熱的早期階段[19]，這與推拿后能即刻降低體溫相似。IL-1β通過血液、體液途徑直接作用于中樞引起發熱[20]，中性粒細胞首先募集到發生感染的部位[21]，分泌IL-1β[22]，引起炎癥反應，中性粒細胞具有兩重作用，一則產生抑菌作用，二則存在細胞毒性，所以當其適當發揮效應后應抑制其活化和浸潤，防止對機體產生傷害[23]，研究結果顯示，退熱六法作用于LPS模型兔后能抑制外周中性粒細胞增多，保護機體免受傷害。脂多糖是一種典型內毒素，作為配體可以激活細胞膜上的TLR4，啟動下游炎癥反應，上調促炎細胞因子。肝臟在調節各種新陳代謝、體內平衡、宿主防御活動中起著關鍵作用，能清除細菌和內毒素，發揮代謝、免疫等功能[24]，TLR4介導LPS誘導的肝組織損傷，使用TLR4抑制劑可以改善肝臟損傷和全身炎癥[25]，LPS誘導大量促炎性介質將中性粒細胞募集到肺組織中，造成肺部的炎性損傷[26]，TLR4作為潛在的治療標記，可用于抑制肺部的炎癥反應，根據研究結果顯示，退熱六法干預能抑制肝臟和肺臟組織中TLR4的表達量。

綜上，本研究揭示了退熱六法對LPS引起的炎癥性發熱具有退熱作用，研究表明，退熱六法能抑制外周炎癥反應，下調中性粒細胞比率，影響TLR4信號通路，下游通路不涉及NF-κB p65，這些結果為推拿治療小兒發熱提供了科學依據，回答了臨床上推拿退熱的部分理論機制。