顱內動脈瘤組織中Septin4 的表達及其通過調節自噬對人腦血管平滑肌細胞的作用研究

楊明環，張波，鄧愛平，張力，曹剛

[1.十堰市太和醫院(湖北醫藥學院附屬醫院),湖北 十堰 442000；2.珠海市中西醫結合醫院(南方醫科大學附屬珠海醫院)腦外科，廣東 珠海 519000]

顱內動脈瘤(intracranial aneurysm，IA)是一種嚴重的神經系統疾病，生存率低，預后差[1]。IA是由血管畸形引起的，在全世界范圍內患病率為3.2%。除了先天性因素外，后天性因素如吸煙、高血壓和過度飲酒等其他因素也有助于IA的形成和發展[2]。IA由于其高發病率，高致殘、致死率的特點，一直以來備受人們的關注。血管細胞功能障礙、血管壁退行性改變、炎癥和免疫反應等內在因素也在IA的發生中起重要作用[3]。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的表型調控與IA的破裂和形成有關[4]。Septin4是Septins家族的一個亞型，具有GTPase活性，有多個剪接體。Septin4是細胞骨架的重要組成部分，參與許多重要的生理過程，如細胞運輸和凋亡[5]。最近的研究[6]表明，Septin4通過調節人主動脈平滑肌細胞的表型轉化調控動脈粥樣硬化疾病進展。目前，關于Septin4在IA中的作用及其可能的作用機制尚不明確。因此，本研究以IA和人腦血管平滑肌細胞(human brain vascular smooth muscle cells，HBVSMCs)為研究對象，旨在探究Septin4在IA中的表達，及對HBVSMCs表型轉化的作用及其可能的作用機制，以期為探明IA的發病機制及開發新的臨床治療策略提供新的科學依據。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

選取2017年1月至2018年3月行開顱動脈瘤夾閉術切除的32份IA組織樣本，患者中男21例，女11例，年齡37～69歲，平均(49.69±8.26)歲。納入標準：數字減影血管造影、CT血管成像確診為IA患者。排除標準：(1)有高血壓、糖尿病、腫瘤等病史者；(2)就診前接受動脈瘤夾閉手術或血管治療者；(3)有顱內多發動脈瘤者。此外，收集同期行顱內血腫清除術或內減壓術的顱腦外傷患者的正常顱動脈組織32份，患者中男18例，女14例，年齡27～63歲，平均(43.38±10.09)歲。IA患者與正常顱動脈患者性別、年齡等一般情況比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要材料與試劑

原代HBVSMCs購自上海信裕生物科技有限公司；平滑肌22α(SM22α)和平滑肌α肌動蛋白(αSMA)抗體購自英國Abcam公司；Lipofectamine2000TM轉染試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TAKARA公司；過表達Septin4載體(簡稱Septin4)及其陰性對照(NC)、Septin4 si-RNA干擾序列(si-Septin4-1和si-Septin4-2)及其陰性對照(si-NC)購自上海吉凱基因化學技術有限公司；Septin4、基質金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9、微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)、sequestosome 1(p62)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶[p-AMPK(Thr172)]、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、磷酸化哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白[p-mTOR(Ser2448)]和哺乳動物類雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體購自美國Cell Signaling Technologies公司。

1.3 免疫組化檢測Septin4蛋白表達

臨床標本用4%多聚甲醛固定72 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋、切片。常規脫蠟至水，3% H2O2避光孵育15 min，PBS清洗后5%BSA避光孵育1 h，Septin4一抗稀釋液(1∶400)4 ℃孵育過夜。二抗稀釋液(1∶200)避光孵育1 h。DAB顯色液顯色，蘇木素染液染色5 min。自來水沖洗，1%鹽酸酒精溶液分化10 s,0.2%氨水做返藍處理8 s，自來水沖洗后切片進行脫水、透明處理，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察分析。

1.4 免疫熒光染色檢測SM22α和αSMA表達

石蠟切片常規脫蠟至水，3%H2O2避光孵育15 min，PBS清洗后5%BSA避光孵育1 h。SM22α(1∶400)和αSMA(1∶200)抗體4 ℃孵育過夜。熒光標記二抗(1∶200)避光孵育30 min，DAPI室溫染核20 min。防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡觀察。

1.5 細胞培養

HBVSMCs用含10% FBS的DEMD(高糖)培養基于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞密度達到80%～90%時，0.25%胰酶液消化細胞，按1∶3比例傳代培養。

1.6 細胞分組與轉染

將HBVSMCs按4×105個·孔-1密度接種于6孔板，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h后將細胞隨機分為空白對照組(NC組)、si-NC組、si-Septin4-1組、si-Septin4-2組，每組設置3個重復，按照Lipofectamine2000TM說明書進行si-NC、si-Septin4-1和si-Septin4-2的轉染。另外，將細胞隨機分為NC組、Septin4組、si-NC組和si-Septin4組，每組設置3個重復，按照Lipofectamine2000TM說明書進行NC、Septin4、si-NC和si-Septin4(干擾效率最高的si-Septin4)的轉染。37 ℃、5%CO2條件下培養48 h后進行后續實驗。

1.7 RT- PCR檢測Septin4 mRNA表達

收集臨床標本或轉染后的HBVSMCs，Trizol法提取細胞總RNA，測定RNA濃度，將RNA逆轉錄合成cDNA。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行RT-PCR實驗。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環。Septin4以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算其mRNA表達。Septin4上游引物5′-CAGATCTGCTTGGGTAGATCC-3′，下游引物5′-CTCGTTCATATCGTGAGTGATGG-3′；GAPDH上游引物5′-ATCCACGGGAGAGCGACAT-3′，下游引物5′-CAGCTGCTTGTAAAGTGGAC-3′。

1.8 蛋白質印跡法檢測蛋白表達

收集臨床標本或轉染后的HBVSMCs，RIPA裂解液裂解外泌體或細胞，取上清，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進行SDS-PAGE分離，隨后將膠中的蛋白轉至PVDF膜上。10%脫脂奶粉室溫封閉3 h，Septin4(1∶2 500)、αSMA(1∶1 000)、SM22α(1∶2 000)、MMP2(1∶5 000)、MMP9(1∶5 000)、LC3(1∶2 000)、p62(1∶1 000)、p-AMPK(1∶2 000)、AMPK(1∶1 000)、p-mTOR(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)4 ℃孵育過夜，HRP標記二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。ECL發光液顯色，暗室曝光。

1.9 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行數據的統計分析，檢測所得數據以均值±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統計學意義則采用LSD(L)檢驗，以雙側P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 IA組織和正常顱動脈組織中Septin4表達水平的比較

免疫組化檢測結果顯示，與正常顱動脈組織相比，IA組織中Septin4陽性細胞數明顯降低(P<0.05)(表1、圖1A)；RT-PCR和蛋白質印跡法檢測結果顯示，與正常顱動脈組織相比，IA組織中Septin4 mRNA和蛋白表達明顯降低(P<0.05)(表1，圖1B、C)。

表1 兩組免疫組化檢測結果比較

2.2 IA組織和正常顱動脈組織中SM22α和αSMA蛋白表達水平的比較

免疫熒光染色結果顯示，與正常顱動脈組織相比，IA組織中SM22α和αSMA熒光強度明顯降低(P<0.05)(表2)。

a與正常顱動脈組織比較，P<0.05

表2 兩組免疫熒光染色結果比較 AU

2.3 si- RNA沉默Septin4的效率檢測

RT-PCR和蛋白質印跡法檢測結果顯示，與si-NC組相比，si-Septin4-1組和si-Septin4-2組細胞Septin4的mRNA和蛋白表達均明顯降低(P<0.05)(表3、圖2)，其中si-Septin4-2組細胞變化更為明顯，因此選取si-Septin4-2進行后續實驗，簡稱為si-Septin4。

表3 不同si-RNA沉默Septin4效率的比較

2.4 Septin4對HBVSMCs表型轉化的影響

RT-PCR檢測結果顯示，與NC組相比，過表達Septin4組細胞中Septin4 mRNA表達明顯升高(P<0.05)；與si-NC組相比，si-Septin4組細胞中Septin4 mRNA表達明顯降低(P<0.05)(表4、圖3A)。蛋白質印跡法檢測結果顯示，與NC組相比，過表達Septin4組細胞中Septin4、αSMA和SM22α蛋白表達明顯升高αSMA和SM22α蛋白表達明顯降低(P<0.05)，MMP2和MMP9蛋白表達明顯升高(P<0.05)(表5、圖3B、C)。

表5 4組 αSMA、SM22α、MMP2和MMP9的蛋白表達結果比較

a與si-NC組比較，P<0.05

表4 4組HBVSMCs表型轉化的結果比較

2.5 Septin4對HBVSMCs細胞自噬的影響

蛋白質印跡法檢測結果顯示，與NC組相比，Septin4組細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達明顯降低(P<0.05)，p62蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與si-NC組相比，si-Septin4組細胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達明顯升高(P<0.05)，p62蛋白表達明顯降低(P<0.05)(表6、圖4)。

2.6 Septin4對AMPK/mTOR信號通路的影響

蛋白質印跡法檢測結果顯示，與NC組相比，Septin4組細胞中p-AMPK/AMPK蛋白表達明顯降低(P<0.05)，p-mTOR /mTOR蛋白表達明顯升高(P<0.05)；與si-NC組相比，si-Septin4組細胞中p-AMPK/AMPK蛋白表達明顯升高(P<0.05)，p-mTOR /mTOR蛋白表達明顯降低(P<0.05)(表7、圖5)。

3 討 論

IA是由顱內動脈壁的病理性局部擴張形成的腫瘤樣突起。IA的破裂是蛛網膜下腔出血的主要原因，其發病率和死亡率較高[7]。到目前為止，IA的確切發病機制仍不清楚。VSMCs具有可塑性高和收縮功能強的特點。在病理條件下，它可以從具有收縮功能的分化表型轉變為具有較強增殖和遷移能力的去分化表型。VSMCs通過表型調節參與IA形成、發展和破裂的發病機理[8]。因此，本研究旨在探究Septin4對HBVSMCs表型轉化的影響及其可能的作用機制，以期為IA確切發病機制的探明及治療提供新的科學依據。

VSMCs是血管壁中主要的細胞類型，具有多種功能。VSMCs有收縮型和合成型兩種不同的類型。收縮表型的標志物包括SM22α、αSMA、平滑肌肌球蛋白重鏈(SM myosin heavy chain，MHC)、h1-calponin和smoollin，合成型的標志物有MMPs[9]。在炎癥和氧化應激等病理刺激下，收縮表型的VSMCs可以轉化為合成型，SM22α和αSMA等表達下調，MMPs以及其他炎癥介質的表達上調。VSMCs失去收縮能力，但有助于促炎細胞的募集和血管壁細胞外基質的重塑[10]。VSMCs表型調控與IA的形成、生長和破裂有關。氧化應激可以誘導表型轉換的VSMCs刺激促炎過程、細胞外基質重塑和壁細胞凋亡，最終促進IA的形成和破裂[11]。Septins除了具有胞質分裂的作用和絲形成能力外，還參與膜動力學、細胞骨架重建、囊泡運輸和腫瘤發生等生物學進程[12]。已有研究表明，Septin4參與調控VSMCs表型轉化[6]，該研究結果提示，Septin4可能在IA疾病進展中發揮重要作用。本研究結果顯示，IA組織中SM22α和αSMA表達下調，提示IA組織中VSMCs向合成型表型轉化，此外IA組織中Septin4表達下調。體外實驗結果顯示，過表達Septin4可上調SM22α和αSMA表達，下調MMP2和MMP9表達，而干擾Septin4后則表現相反變化，該結果表明，Septin4可促進HBVSMCs向收縮型表型轉化。

a與NC組比較，P<0.05；b與si-NC組比較，P<0.05

a與NC組比較，P<0.05；b與si-NC組比較，P<0.05

細胞自噬被認為是調控VSMCs表型轉換的機制之一[13]。激活細胞自噬可促進VSMCs由收縮表型轉化為合成表型，從而參與IA的發生發展[14]。研究表明，IA組織中miR-4735表達下調，過表達miR-4735通過靶向HIF-1α抑制HIF-1α介導的自噬，抑制VSMCs遷移和侵襲，從而抑制IA疾病進展[15]。已有研究[16]表明，Septin4可抑制VSMCs向合成型表型轉化和細胞自噬。本研究結果顯示，過表達Septin4可上調自噬相關蛋白p62蛋白表達，抑制LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達，而干擾Septin4后則表現相反作用。結果表明，Septin4可通過抑制自噬在IA中發揮保護作用。AMPK/mTOR信號通路是復雜信號網絡中介導自噬的經典途徑。mTOR 是一個自噬的負性調節因子，mTOR磷酸化會抑制自噬起始分子ULK1功能。此外，AMPK可通過抑制mTOR活化、磷酸化ULK1激活其活性，從而促進自噬的發生[17]。研究[18]表明，激活VSMCs中AMPK/mTOR/ULK1信號通路可激活自噬，最后誘導VSMCs表型轉化。本研究結果顯示，過表達Septin4可抑制AMPK磷酸化，促進mTOR磷酸化，而干擾Septin4則表現出相反變化。結果表明，Septin4可能通過調節AMPK/mTOR信號通路抑制自噬，在VSMCs中發揮重要作用。

a與NC組比較，P<0.05；b與si-NC組比較，P<0.05

綜上所述，本研究結果表明Septin4在IA中低表達，其可能通過AMPK/mTOR信號通路抑制自噬和HBVSMCs向合成表型轉化，阻滯IA疾病進程。該研究結果為進一步明確Septin4在IA中的作用，及開發新的臨床治療策略提供了科學依據。