長鏈非編碼RNA NR2F1-AS1靶向微小RNA-145-5p調控結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制

趙剛，武青生，趙延禮，馬生彪，王巍，穆元忠

結腸癌是常見的惡性腫瘤，表現為細胞增殖失控，腫瘤復發和轉移是導致其治療失敗的主要原因[1]。目前，結腸癌的病因和發病分子機制尚未完全清楚，探討影響結腸癌細胞惡性行為的分子機制對于闡明結腸癌發病機制的及尋找治療靶點意義重大。長鏈非編碼RNA（lnc RNA）參與腫瘤細胞生物學行為調控的長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，其表達失調與腫瘤進展關系密切[2-3]。lncRNA NR2F1-AS1是核受體亞族2F組成員1（nuclear receptor subfamily 2 group F member 1，NR2F1）的反義 RNA，研究顯示，其在肝細胞癌[4]、骨肉瘤[5]等腫瘤中表達升高，干擾NR2F1-AS1表達可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。但NR2F1-AS1在結腸癌中的表達及其作用還未知。微小RNA（miRNA）在腫瘤進展中也起重要調控作用[6]。lnc RNA可調控miRNA的表達，兩者共同參與腫瘤進程[7]。生物信息學軟件預測顯示，miR-145-5p可能是NR2F1-AS1的靶基因。有報道顯示miR-145-5p在結直腸癌中表達降低，過表達miR-145-5p可抑制癌細胞增殖和侵襲，為結直腸癌的治療提供了潛在治療靶點[8]。目前，NR2F1-AS1能否靶向miR-145-5p調控結腸癌進展還未知。本研究主要探討了NR2F1-AS1和miR-145-5p對結腸癌HCT116細胞惡性行為的影響，分析NR2F1-AS1對miR-145-5p的靶向調控作用，以期從lncRNA/miRNA途徑揭示結腸癌進展的機制，并為結腸癌治療靶點選擇提供新的方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2015年3月至2017年5月青海省第五人民醫院外科手術切除并經病理證實為原發性結腸腺癌組織25例，另留取距腫瘤邊緣3 cm的癌旁組織（正常結腸組織）。其中男16例，女9例，年齡（61.25±5.78）歲。組織高分化7例，中分化9例，低分化9例。淋巴結轉移14例，未轉移11例。病人術前未進行放、化療等治療。病人或其近親屬簽署知情同意書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 細胞和實驗試劑結腸癌細胞株HCT116（中國科學院上海細胞庫），胎牛血清（FBS）（浙江天杭生物科技股份有限公司），RPMI 1640培養基、CCK-8試劑盒、LipofectamineTM2000試劑盒、雙熒光素酶活性檢測試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），胰蛋白酶（美國Sigma公司），si-NR2F1-AS1、si-NC、pcDNA-NR2F1-AS1、pcDNA、miR-145-5p mimcs、miR-NC、anti-miR-145-5p、antimiR-NC（上海吉瑪制藥技術有限公司），逆轉錄試劑盒、RNA抽提試劑盒和PCR試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司），PCR引物（上海生工生物工程公司），鼠抗人細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（P21）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）多克隆抗體（北京中杉金橋生物試劑公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 HCT116細胞培養 復蘇HCT116細胞，加入含10%FBS的RPMI 1640培養基，于37℃、濕度97%、5%二氧化碳的培養箱中培養。顯微鏡觀察細胞生長狀況，待細胞融合至80%左右時，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例傳代。

1.3.2 NR2F1-AS1與miR-145-5p靶向關系驗證生物信息學軟件預測顯示，NR2F1-AS1與miR-145-5p結合的核苷酸序列。PCR擴增含miR-145-5p結合位點的NR2F1-AS1核苷酸序列，插入載體，構建NR2F1-AS1野生型熒光素酶報告載體（WT-NR2F1-AS1）。同時，將結合位點突變后構建NR2F1-AS1突變型熒光素酶報告載體（MUT-NR2F1-AS1）。用LipofectamineTM2000試劑盒分別將WT-NR2F1-AS1、MUT-NR2F1-AS1與miR-145-5p mimic或miR-NC共轉染。24 h后，收集細胞，檢測熒光素酶活性。具體操作參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書。分別轉染si-NR2F1-AS1、si-NC、pcDNA-NR2F1-AS1及pcDNA至HCT116細胞，48 h后收集細胞，實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-145-5p表達水平。

1.3.3 RT-qPCR檢測組織或細胞中NR2F1-AS1和miR-145-5p表達水平 RNA提取試劑盒分離總RNA，檢測RNA純度和濃度后將其逆轉錄為互補DNA（cDNA）。再以cDNA為模板，行PCR擴增。NR2F1-AS1正向5'-CAGCGGTGCAAACCATGTGC-3'，反向5'-GTAAACCAAGTCGGTTGAACG-3'；GAPDH正向5'-CAGTGCCAGCCTCGTCTATG APDH-3'，反 向 5'-CTTCTGACACCTACCGGGGA-3'；miR-145-5p 正向 5'-CCAGCTGGGCTCA CTGAACAATGA-3'，反向 5'-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3'；U6 正向 5'-TGCGGGTG CTCGCTTCGGCAGC-3'，反向 5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。 GAPDH 為NR2F1-AS1的內參，U6為miR-145-5p的內參，用2－ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.3.4 細胞轉染和分組 取1×105個HCT116細胞接種6孔板，用Lipofectami-neTM2000分別將si-NR2F1-AS1（si-NR2F1-AS1組）、si-NC（si-NC組）、miR-145-5p mimcs（miR-145-5p 組）、miR-NC（miRNC組）、si-NR2F1-AS1與anti-miR-145-5p（si-NR2F1-AS1+anti-miR-145-5p組）、si-NR2F1-AS1與 anti-miR-NC（si-NR2F1-AS1+anti-miR-NC組）轉染60%融合的細胞。轉染48 h收集細胞，用于后續實驗。

1.3.5 CCK-8法檢測細胞增殖 各組細胞以每孔5×103個接種于96孔板中，每組設置3個復孔。將CCK溶液和細胞培養液按1∶9混合，在培養24 h、48 h和72 h后，取100 μL加入各孔內孵育，全自動酶標儀在4 h后于450 nm處測定吸光度（optical density，OD）值。實驗重復3次。

1.3.6 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 侵襲實驗：將無血清培養基和Matrigel按照8∶1混合，取50 μL鋪于Transwell上室備用。用無血清培養基重懸各組HCT116細胞調整濃度為5×104個/毫升。在上室、下室中分別加入100 μL細胞懸液、500 μL完全培養基。孵育48 h后取出上室。將Transwell膜下表面的細胞分別用4%多聚甲醛固定、0.4%結晶紫染色。倒置顯微鏡下隨機選取5個視野，對穿膜細胞計數。遷移實驗：無需鋪設Matrigel基質膠，后續實驗步驟與侵襲實驗相同。

1.3.7 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測蛋白表達 RIPA法提取總蛋白后進行蛋白定量。取適量蛋白置于100℃煮沸5 min。冷卻至室溫后，每組樣本取30 μg行聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉膜后進行膜的封閉。用一抗孵育液在4℃孵育膜10 h。洗膜后，再用二抗孵育液在37℃孵育膜1 h。洗膜后，進行化學發光顯色、凝膠成像系統拍照。以Image J軟件分析蛋白條帶相對內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的灰度值。

1.4 統計學方法利用SPSS 22.0軟件分析實驗數據。計量資料以±s表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌組織中NR2F1-AS1和miR-145-5p的表達與癌旁組織比較，結腸癌組織中NR2F1-AS1表達升高，miR-145-5p表達降低（P<0.05）。見表1。

表1 NR2F1-AS1和miR-145-5p在結腸癌組織中的表達/±s

表1 NR2F1-AS1和miR-145-5p在結腸癌組織中的表達/±s

注：①與癌旁組織比較，P<0.05。

組別癌旁組織結腸癌組織t值P值miR-145-5p 1.00±0.08 0.55±0.05①23.85 0.000例數25 25 NR2F1-AS1 1.01±0.11 3.39±0.33①34.21 0.000

2.2 NR2F1-AS1靶向調控miR-145-5p的表達NR2F1-AS1與miR-145-5p序列存在結合位點（圖1）。共轉染WT-NR2F1-AS1的miR-145-5p組細胞熒光素酶活性為0.49±0.05，低于miR-NC組1.03±0.09（t=15.735，P<0.001）；而共轉染 MUT-NR2F1-AS1的miR-145-5p組細胞熒光素酶活性為1.01±0.08，與miR-NC組細胞熒光素酶活性1.00±0.07比較，差異無統計學意義（t=0.282，P=0.781）。pcDNANR2F1-AS1組miR-145-5p表達水平為0.44±0.04，低于 pcDNA 組 1.00±0.08（t=18.783，P<0.001）。 si-NR2F1-AS1組miR-145-5p表達水平為2.88±0.27，高于si-NC組0.98±0.09（t=20.028，P<0.001）。

圖1 NR2F1-AS1的序列中含有與miR-145-5p互補的核苷酸序列

2.3 干擾NR2F1-AS1表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的影響與si-NC組相比，si-NR2F1-AS1組細胞中NR2F1-AS1表達水平降低（P<0.05），表明轉染si-NR2F1-AS1可干擾NR2F1-AS1表達。與si-NC組比較，si-NR2F1-AS1組P21蛋白水平高于si-NC組（P<0.05），CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平以及OD值、遷移和侵襲數低于si-NC組（P<0.05）。見圖2和表2。

圖2 干擾NR2F1-AS1表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲影響的相關蛋白表達

表2 干擾NR2F1-AS1表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

表2 干擾NR2F1-AS1表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

注：Cyclin D1為細胞周期蛋白D1，P21為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，MMP-2為基質金屬蛋白酶-2，MMP-9為基質金屬蛋白酶-9。

組別MMP-9蛋白重復次數NR2F1-AS1 OD值（450 nm）24 h 48 h 72 h遷移細胞數/個侵襲細胞數/個CyclinD1蛋白p21蛋白MMP-2蛋白si-NC si-NR2F1-AS1 t值P值0.72±0.07 0.30±0.03 16.545 0.000 9 9 1.01±0.09 0.53±0.05 13.987 0.000 0.61±0.06 0.52±0.04 3.744 0.002 1.21±0.11 0.68±0.06 12.690 0.000 1.62±0.13 0.87±0.07 19.099 0.000 126.39±11.43 61.48±6.57 14.771 0.000 108.26±10.22 52.47±5.63 14.344 0.000 0.63±0.06 0.25±0.03 16.994 0.000 0.33±0.03 0.78±0.07 17.726 0.000 0.69±0.06 0.27±0.03 18.783 0.000

2.4 miR-145-5p過表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的影響miR-145-5p組細胞miR-145-5p表達水平高于miR-NC組（P<0.05），表明轉染miR-145-5p mimics能夠上調miR-145-5p表達水平。miR-145-5p組細胞P21蛋白水平高于miR-NC組（P<0.05），而CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平、OD值、遷移和侵襲數低于miR-NC組（P<0.05）。見圖3和表3。

圖3 miR-145-5p過表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲影響的相關蛋白表達

表3 miR-145-5p過表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

表3 miR-145-5p過表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

注：Cyclin D1為細胞周期蛋白D1，P21為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A，MMP-2為基質金屬蛋白酶-2，MMP-9為基質金屬蛋白酶-9。

分組重復次數p21蛋白miR-145-5p 48 h 72 h遷移細胞數/個侵襲細胞數/個CyclinD1蛋白MMP-2蛋白MMP-9蛋白OD值（450 nm）24 h miR-NC miR-145-5p t值P值1.00±0.071.25±0.101.66±0.14123.48±12.41103.59±10.360.61±0.060.32±0.030.68±0.060.74±0.07 0.35±0.03 15.363 0.000 9 9 2.84±0.27 19.790 0.000 0.62±0.06 0.59±0.05 1.152 0.266 0.74±0.07 12.534 0.000 0.96±0.08 13.024 0.000 68.36±6.58 11.772 0.000 59.33±5.42 11.356 0.000 0.28±0.03 14.758 0.000 0.71±0.07 15.363 0.000 0.33±0.03 15.652 0.000

2.5 抑制miR-145-5p表達逆轉了干擾NR2F1-AS1表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的作用si-NR2F1-AS1+anti-miR-145-5p組細胞CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白水平以及OD值、遷移和侵襲數高于si-NR2F1-AS1+anti-miR-NC組，miR-145-5p表達水平和P21蛋白水平低于si-NR2F1-AS1+anti-miR-NC組（P<0.05）。見圖4和表4。

圖4 增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

表4 抑制miR-145-5p表達逆轉了干擾NR2F1-AS1表達對結腸癌HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的作用（xˉ±s，n=9）

3 討論

Lnc RNA是腫瘤發生發展的重要調控因子。NR2F1-AS1是近年來新發現的一種調控腫瘤發展進程的lnc RNA。Guo等[9]研究顯示，NR2F1-AS1在甲狀腺癌組織和細胞中呈高表達，其通過靶向上調miR-338-3P 表達抑制甲狀腺癌進展。Wang等[10]研究顯示，NR2F1-AS1在子宮內膜癌中表達升高，抑制NR2F1-AS1表達對子宮內膜癌細胞活力和轉移能力具有顯著抑制作用，這與其靶向上調miR-363表達有關。本研究發現，結腸癌組織中NR2F1-AS1表達水平明顯高于癌旁組織，提示NR2F1-AS1可能參與結腸癌啟動和發展。轉染si-NR2F1-AS1至結腸癌HCT116細胞進行功能實驗，結果顯示干擾NR2F1-AS1表達可降低HCT116細胞活力，減少遷移和侵襲細胞數，同時伴有促增殖蛋白CyclinD1、促轉移蛋白MMP-2和MMP-9的表達下降以及抗增殖蛋白P21蛋白的表達升高，提示NR2F1-AS1可能是結腸癌的潛在治療靶點。

生物信息學軟件預測顯示，miR-145-5p可能是NR2F1-AS1的靶基因。為探討NR2F1-AS1抗結腸癌的可能機制，本研究開展雙熒光素酶報告基因法證實NR2F1-AS1可與miR-145-5p直接結合。隨后的分析顯示干擾NR2F1-AS1能夠促進miR-145-5p表達，而NR2F1-AS1過表達則對miR-145-5p水平具有抑制作用，提示結腸癌中存在NR2F1-AS1/miR-145-5p 分子軸。miR-145-5p 在前列腺癌[11]、膀胱癌[12]、非小細胞肺癌[13]等腫瘤中表達降低，作為抑癌基因參與腫瘤的發生發展。本研究顯示，miR-145-5p在結腸癌組織中呈低表達，過表達miR-145-5p可抑制HCT116細胞增殖、遷移和侵襲，與相關報道結果一致[8]，證實miR-145-5p在結腸癌中的抑癌作用，提示上調miR-145-5p表達有助于阻礙結腸癌進程。本研究還顯示，干擾miR-145-5p表達可逆轉干擾NR2F1-AS1表達對HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，提示干擾NR2F1-AS1表達通過靶向上調miR-145-5p表達發揮抗結腸癌作用。

總之，在結腸癌組織NR2F1-AS1表達升高，干擾NR2F1-AS1可能通過上調miR-145-5p表抑制結腸癌細胞HCT116細胞惡性行為，發揮抗結腸癌作用，是結腸癌治療的潛在靶點。但本研究還存在不足之處，僅在細胞層面探討了NR2F1-AS1對結腸癌的影響，接下來將通過裸鼠實驗模型進一步探討NR2F1-AS1對結腸癌細胞裸鼠移植瘤生長的影響及其它可能的調控機制。