妊娠期合并心臟病病人血清中MTHFR基因C677T位點多態性與母嬰結局關系

孔令娟，李恩彩，崔廣樹

妊娠合并心臟病是產科危重癥，其會使孕婦脆弱的循環系統代謝失償，進一步造成母體和胎兒死亡、巨大兒、新生兒窒息、早產等不良妊娠結局[1-3]，給家庭帶來嚴重影響。近年來對不良妊娠結局研究從遺傳、環境因素等層面上升到了分子生物學層面，研究發現5，10-亞甲基葉酸還原酶（5，10-methylene folate reductase，MTHFR）與葉酸代謝有關，其基因突變與自然流產、早產、新生兒窒息等、心血管疾病等不良妊娠結局有關[4]。Al-Achkar等[5]研究發現MTHFR基因的C677T多態性是復發性流產的危險因素，具有C677T突變型TT型孕婦流產風險高。Dekker等[6]研究顯示母體受孕期間過度服用葉酸對兒童肺功能產生不利影響，可能與MTHFR基因位點C677T突變有關。然而，有關妊娠期合并心臟病病人血清中MTHFR基因C677T位點多態性與母嬰結局關系研究鮮有報道，因此本研究探討妊娠期合并心臟病病人血清中MTHFR基因C677T位點多態性與母嬰結局關系，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年2月至2019年10月德州市婦女兒童醫院妊娠合并心臟病病人88例為妊娠期心臟病組，年齡范圍為22～38歲，年齡（28.52±2.35）歲；另同期選取與妊娠合并心臟病組相近年齡段的92例健康孕婦為對照組，年齡范圍為23～36歲，年齡（29.06±2.87）歲。兩組年齡差異無統計學意義（P>0.05）。所有入選對象均為單胎妊娠，均按時進行常規產前檢查至分娩，并由專人隨訪記錄相應妊娠結局。診斷標準：參考中華醫學會婦產科學分會產科學組編撰的《妊娠合并心臟病的診治專家共識（2016）》[7]。納入標準：（1）符合NYHA心功能分級Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級者；（2）臨床資料完整者；（3）漢族人。排除標準：（1）伴有其它嚴重并發癥者；（2）中途退出者；（3）依從性差者；（4）嚴重肝、腎等臟器功能不全者。所有研究對象及近親屬均簽署知情同意書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 試劑與儀器全血基因組DNA快速抽提試劑盒（貨號NG-8647）購自美國OMEGA公司，Taq DNA聚合酶（貨號68N25）、dNTP（貨號NQ2056）、100bp DNA ladder（貨號SM0321）、限制性內切酶Hnif Ⅰ（貨號SM8937）均購自賽默飛世爾生物科技有限公司，C677T多態性位點PCR引物（貨號NM-2130）由上海英駿生物工程公司合成并提供；PCR分析儀（型號ABI7500）購自北京智杰方遠科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提取及擴增 孕婦待產前，收集兩組所有研究對象空腹靜脈血2 mL于抗凝管中置-80℃冰箱保存待用。后經常規解凍后采用全血基因組DNA快速抽提試劑盒提取外周血基因組DNA，嚴格按照操作說明書進行。PCR擴增反應體系：滅菌雙蒸水14.2 μL，10×PCR緩沖液2 μL，dNTP 1.6 μL，正向引物與反向引物各 0.5 μL，DNA 模板 1 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火45 s、72℃延伸45 s，以上三個步驟循環35次，最后72℃延伸10 min。反應結束后取出離心備用，對產物進行純化。采用限制性內切酶Hnif Ⅰ酶切鑒定。酶切反應體系：10×Buffer 1.5 μL，0.1×BSA 1.5 μL，Hnif Ⅰ 0.8 μL，PCR產物DNA 6 μL，ddH2O 5.2 μL。單管反應體積15 μL。反應條件：37℃下溫浴2 h，10× Buffer 1.5 μL終止反應。酶切產物以3.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后，采用凝膠成像系統分析單核苷酸多態性基因型結果。C677T多態性位點引物序列見表1。

表1 基因多態性位點引物設計

1.3.2 觀察指標 記錄并比較兩組孕產婦不良母嬰結局：巨大兒、新生兒低血糖、新生兒窒息、早產兒事件發生率。

1.4 統計學方法采用統計學軟件SPSS 19.0進行數據統計分析，符合正態分布的計數資料以例（%）表示，兩組間比較采用χ2檢驗；采用Hardy-Weinbery平衡檢測平衡程度。所有數據均以P<0.05代表差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTHFR基因C677T位點基因型多態性Hnif Ⅰ酶切結果顯示，C677T位點基因型包括：僅有152 bp片段的為野生型（CC），有98 bp和54 bp片段的為純合子（TT），既有152 bp又有98 bp、54 bp片段的是雜合子（CT），見圖1。

圖1 C677T位點基因型檢測

2.2 Hardy-Weinberg平衡定律檢驗根據Hardy-Weinberg平衡定律，對照組與妊娠期心臟病組MTHFR基因C677T位點各基因型的期望值和觀察值進行χ2檢驗，均P>0.05，符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示群體來自同一孟德爾群體，所選樣本進行群體遺傳學研究具有代表性。見表2。

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗兩組MTHFR基因C677T位點各基因型期望值和觀察值結果/例

2.3 MTHFR基因C677T位點多態性分析與對照組相比，妊娠期心臟病組MTHFR基因C677T位點CT、TT基因型及T等位基因頻率顯著升高（P<0.05）。見表3。

表3 對照組與妊娠期心臟病組MTHFR基因C677T位點多態性分析/例（%）

2.4 MTHFR基因C677T位點多態性與妊娠結局關系與野生CC型比較，妊娠期心臟病組孕婦突變型雜合子CT型、純合子TT型病人巨大兒、新生兒低血糖、新生兒窒息、早產兒發生率均升高；與雜合子CT型比較，純合子TT型病人巨大兒、新生兒低血糖、新生兒窒息、早產兒發生率升高。見表4。

2.5 妊娠期心臟病病人不良妊娠結局的影響因素分析以是否發生不良妊娠結局為因變量，以MTHFR基因C677T位點野生CC型、雜合子CT型、純合子突變TT型為自變量進行二元logistic回歸分析顯示，與MTHFR基因C677T位點野生CC型比較，雜合子CT型、純合子突變TT型發生不良妊娠結局的風險分別為2.033倍、1.753倍。見表5，6。

表5 變量賦值表

表6 妊娠期心臟病病人不良妊娠結局的危險因素分析

3 討論

妊娠合并心臟病是嚴重妊娠并發癥，如未使用恰當的處理方法可能會造成嚴重不良妊娠結局。王宏麗等[8]研究發現，心功能分級越高，自然分娩率越低，早產、新生兒窒息、低體重兒等不良結局發生率越高。因此為了有效改善不良妊娠結局，對妊娠合并心臟病病人妊娠結局相關影響因素進行深入分析在臨床上意義重大。隨著分子生物學技術的快速發展，MTHFR基因及其基因突變與不良妊娠結局的關系越來越受到關注。

MTHFR基因位于染色體1p36.3，是葉酸代謝過程中關鍵酶類。MTHFR首先將5，10-亞甲基四氫葉酸轉化為5，10-甲基四氫葉酸，5，10-甲基四氫葉酸使同型半胱氨酸甲基化為蛋氨酸[9-11]。MTHFR基因突變使MTHFR活性降低，使5，10-亞甲基四氫葉酸向5，10-甲基四氫葉酸的轉化減弱，進一步導致同型半胱氨酸甲基化為蛋氨酸受阻，從而使同型半胱氨酸堆積，最終引起高同型半胱氨酸血癥[12]。高同型半胱氨酸升高使甲基轉移酶受抑制，進一步造成低甲基化，最終使染色體不分離，從而導致不良妊娠結局（如唇腭裂、新生兒畸形、早產等）發生[13]。郭從從等[14]研究發現，MTHFR基因C677T位點多態性可能與先天性心臟病發生發展密切相關。本研究結果顯示，MTHFR基因C677T位點多態性有野生型（CC）、純合子型（TT）、雜合子型（TC），且C677T位點多態性分布頻率服從Hardy-Weinberg平衡定律，提示所選樣本均來自同一孟德爾群體，所選樣本進行群體遺傳學研究具有代表性。

研究發現，與正常妊娠孕婦相比，不良妊娠孕婦MTHFR C677T位點C/C型基因頻率、C等位基因頻率明顯降低，C/T、T/T基因型頻率及T等位基因頻率明顯升高，提示MTHFR基因多態性與不良妊娠結局關系密切[15]。本研究發現，妊娠期心臟病組MTHFR基因C677T位點CT、TT基因型及T等位基因頻率分布顯著高于對照組。與吳素琴等研究結果一致，也說明MTHFR基因C677T位點多態性與不良妊娠結局有密切關系。再次研究發現，妊娠期心臟病組中MTHFR基因C677T位點雜合子CT型、純合子TT型病人巨大兒、新生兒低血糖、新生兒窒息、早產兒發生率均高于野生CC型；純合子TT型病人巨大兒、新生兒低血糖、新生兒窒息、早產兒發生率均高于雜合子TC型。提示妊娠期心臟病組中攜帶突變T基因突變病人不良妊娠結局發生率高于無T突變基因病人。研究發現，MTHFR C677 TT型是導致育齡期女性不良妊娠結局發生的獨立危險因素[16]。提示MTHFR C677能夠明顯增加不良妊娠結局的發生。最后二元logistic回歸分析結果發現，MTHFR基因C677T位點雜合子CT型、純合子突變TT型發生不良妊娠結局的風險分別是野生CC型的2.033倍、1.753倍。進一步提示MTHFR基因多態性不僅與妊娠期心臟病相關，且C677T純合突變與不良妊娠結局關系密切。卜春艷等[17]研究顯示，MTHFR基因C677T位點雜合子CT型、純合子突變TT型與妊娠孕婦子癇前期發病風險有一定相關性，在子癇前期高風險孕婦中進行MTHFR基因C677T多態性分析，及時補充葉酸，有助于預防子癇前期發生。以此推測臨床上對妊娠期心臟病確診或可疑孕婦結合MTHFR C677T位點多態性檢測，且對TT高風險及CT中風險孕婦補充不同劑量葉酸可能有助于降低不良妊娠發生率。

綜上所述，MTHFR基因多態性不僅與妊娠期心臟病相關，且與妊娠期心臟病不良妊娠結局關系密切。研究也存在一定不足，樣本選擇受制于地區、例數、人群，需進一步擴大地區、擴大樣本進一步證實MTHFR基因突變與妊娠期心臟病病人母嬰結局的關系。