泛素羧基末端水解酶L1、膠質纖維酸性蛋白水平對新生兒窒息腦損傷的診斷價值

鄭小冬，祝毓斌，林魯飛，蔡文燕，吳岳彪

新生兒窒息是一種由各種原因所致母體-胎兒間通過胎盤血流進行氣體交換發生急性障礙時，胎兒出現嚴重缺氧和酸中毒及呼吸、循環、中樞神經系統抑制，致使胎兒出生后不能正常呼吸的兒科臨床危重疾病[1]。近年研究表明，中國新生兒窒息發病率呈較高水平[2]。腦損傷指產前、產時、出生后各種病理因素所引起的不同程度的腦缺血或出血性損害，新生兒窒息后主要并發癥之一，腦損傷嚴重時會引發腦癱等后遺癥，影響新生兒生命健康。目前國內外對新生兒窒息后腦損傷相關研究已有較多，但對其早期診斷方面研究仍有不足。因此繼續探尋新生兒窒息后腦損傷診斷因子，對及時發現并治療新生兒窒息后腦損傷有重要意義。程啟慧等研究發現，急性缺血性腦卒中患者血清泛素羧基末端水解酶L 1（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase L 1，UCH-L 1）水平顯著升高，與病情嚴重程度和預后有關[3]。祝善堯等[4]研究報道，膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）在嬰兒痙攣癥病兒血清和腦脊液中高表達，有助于判斷病兒中樞神經系統受損程度。有研究表明，UCH-L 1和GFAP聯合檢測可用于評估心臟驟停病兒腦損傷水平[5]。由于UCH-L 1和GFAP在新生兒窒息后腦損傷中聯合探究鮮有報道，本研究通過檢測新生兒窒息后腦損傷病兒血清UCH-L 1、GFAP表達水平，分析二者與疾病進展關系及對疾病診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016年1月至2019年5月海口市第四人民醫院收治的窒息新生兒126例，病兒日齡1～5 d。根據Apgar評分[6]標準將入組病兒分為重度窒息組57例，其中男30例，女27例，1 min Apgar評分為0～3分；輕度窒息組69例，男38例，女31例，1 min Apgar評分為4～7分。另根據病兒出生后1～5 d顱腦B超、CT或核磁共振掃描結果（是否患有缺血缺氧性腦病[6]），將入組病兒分為腦損傷組（77例）和無腦損傷組（49例）。納入標準：（1）符合新生兒窒息診斷標準[7]；（2）臨床資料完整。排除標準：（1）早產兒；（2）合并患有感染性、先天性代謝類疾病；（3）合并患有黃疸、溶血性疾病；（4）母體孕期患有妊娠期高血壓疾病。另選取同期在海口市第四人民醫院出生的健康新生兒123例為對照組，健康新生兒日齡1～5 d。本研究中所有受試新生兒近親屬對本研究知情并簽署知情同意書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 主要儀器和試劑多功能酶標儀（型號Multiskan MK3，美國Thermo公司）、UCH-L 1酶聯免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號JL19379，上海江萊生物科技有限公司）、GFAP ELISA試劑盒（貨號JL023505，上海江萊生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集及一般資料收集 受試窒息新生兒及健康新生兒均于入組后第2天清晨（7：00～9：00）收集外周靜脈血2 mL。4℃、3 000 r/min離心20 min后，于?80℃條件下保存備用。

入組時收集新生兒性別、胎齡、日齡、出生時體重等一般資料，并于出生后14 d時對窒息新生兒進行新生兒神經行為評估（neonatal behavioral neurological assessment，NBNA）評分[8]測定。NBNA 評分總分為40分，<37分為異常。

1.3.2 血清UCH-L 1、GFAP水平測定 采用ELISA法測定所有受試新生兒血清UCH-L 1、GFAP水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 統計學方法使用SPSS 21.0對本研究數據進行分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析，總體有差異者再進行LSD-t檢驗。計數資料以例（%）表示，用χ2檢驗。Pearson法進行相關性分析，logistic回歸模型分析進行危險因素分析，ROC曲線進行診斷價值分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重度窒息組、輕度窒息組及對照組一般資料比較重度窒息組、輕度窒息組及對照組性別、胎齡、平均日齡、出生時體質量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。重度窒息組病兒1 min Apgar評分明顯低于輕度窒息組和對照組（P<0.05），輕度窒息組1 min Apgar評分明顯低于對照組（P<0.05）。重度窒息組NBNA評分明顯低于輕度窒息組（P<0.05）。見表1。

表1 窒息新生兒126例重度窒息組、輕度窒息組及對照組一般資料比較

2.2 重度窒息組、輕度窒息組及對照組血清UCHL 1、GFAP水平比較重度窒息組血清UCH-L 1、GFAP水平均明顯高于輕度窒息組和對照組（P<0.05），輕度窒息組血清UCH-L 1、GFAP水平均明顯高于對照組（P<0.05）。見表2。

表2 窒息新生兒126例重度窒息組、輕度窒息組及對照組血清UCH-L 1、GFAP水平比較/（ng/mL，±s）

表2 窒息新生兒126例重度窒息組、輕度窒息組及對照組血清UCH-L 1、GFAP水平比較/（ng/mL，±s）

注：UCH-L 1為泛素羧基末端水解酶L 1，GFAP為膠質纖維酸性蛋白。①與對照組比較，P<0.05。②與輕度窒息組比較，P<0.05。

例數123 69 57 UCH-L 1 0.78±0.25 1.36±0.42①2.19±0.71①②201.30 0.000組別對照組輕度窒息組重度窒息組F值P值GFAP 0.48±0.16 1.14±0.28①1.65±0.49①②322.90 0.000

2.3 腦損傷和無腦損傷組病兒血清UCH-L 1、GFAP水平比較腦損傷組血清UCH-L 1、GFAP水平明顯高于無腦損傷組（P<0.05），腦損傷組NBNA評分明顯低于無腦損傷組（P<0.05）。見表3。

表3 腦損傷和無腦損傷組病兒血清UCH-L 1、GFAP水平比較/±s

表3 腦損傷和無腦損傷組病兒血清UCH-L 1、GFAP水平比較/±s

注：UCH-L 1為泛素羧基末端水解酶L1，GFAP為膠質纖維酸性蛋白，NBNA為神經行為評估。

例數49 77 UCH-L 1/（ng/mL）0.57±0.18 2.31±0.60 19.72 0.000組別無腦損傷組腦損傷組t值P值GFAP/（ng/mL）0.39±0.12 1.76±0.43 21.74 0.000 NBNA評分/分37.24±2.18 31.62±3.11 11.03 0.000

2.4 窒息后腦損傷病兒血清UCH-L 1、GFAP水平與NBNA評分相關性窒息后腦損傷病兒血清UCH-L 1、GFAP水平均與NBNA評分呈負相關（r=?0.471，P=0.000；r=?0.415，P=0.000），見圖1，2。

圖2 窒息后腦損傷病兒血清GFAP水平與NBNA評分相關性

2.5 新生兒窒息后腦損傷危險因素分析以本研究資料為樣本，以新生兒窒息后是否發生腦損傷為應變量建立Logistic回歸模型，將1 min Apgar評分、NBNA評分、UCH-L 1水平、GFAP水平轉化為二分類變量后為自變量納入Logistic回歸模型，選擇逐步向后法、行LR檢驗。結果顯示，低1 min Apgar評分、低NBNA評分、高UCH-L 1水平、高GFAP水平是影響新生兒窒息后腦損傷發生的獨立危險因素（P<0.05）。

2.6 血清UCH-L 1、GFAP對新生兒窒息后腦損傷診斷價值由圖3分析可知，血清UCH-L 1預測新生兒窒息后腦損傷的曲線下面積為0.802，閾值為1.35，靈敏度為83.10%，特異度為82.00%。血清GFAP預測新生兒窒息后腦損傷的曲線下面積為0.829，閾值為1.12，靈敏度為84.40%，特異度為76.00%。兩者聯合預測新生兒窒息后腦損傷的曲線下面積為0.876，靈敏度為89.60%，特異度為88.00%。

圖3 血清UCH-L 1、GFAP水平對新生兒窒息后腦損傷診斷效能ROC曲線圖

3 討論

窒息新生兒娩出時出現全身皮膚青紫或蒼白、呼吸淺表、肌肉張力松弛等癥狀，可能引起腦損傷等并發癥，出現智力低下、肢體抽搐、語言功能障礙、聽覺障礙等，給家庭和社會帶來嚴重精神和經濟方面壓力[9]。早期診斷有助于病情及早發現和控制。本研究結果顯示，重度窒息組病兒NBNA評分明顯低于輕度窒息組病兒，提示窒息新生兒腦損傷程度隨窒息程度增大而加重。

泛素羧基末端水解酶（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase，UCH）與泛素介導的蛋白質降解過程有關。UCH-L 1屬于UCH家族成員，具有去泛素化、抑制泛素連接酶活性、穩定泛素單體等作用，可參與細胞增殖、周期、分化、凋亡等過程，與機體炎癥、免疫、損傷修復等調控有關[10]，在腦中樞神經和周圍神經中分布廣泛。Wang等[11]研究發現，UCHL 1可能作為外傷性腦損傷標志物，用于預測患者患病嚴重程度及預后。有研究證實，新生兒缺氧缺血性腦病病兒出生后24 h血漿中UCH-L 1表達水平升高，與病兒腦損傷加重有關[12]。本研究結果顯示，重度窒息組病兒血清UCH-L 1水平均明顯高于輕度窒息組病兒和對照組，輕度窒息組病兒血清UCH-L 1水平均明顯高于對照組。且腦損傷組病兒血清UCH-L 1水平明顯升高，與NBNA評分呈負相關。與Massaro等[12]研究結果相似，提示血清UCH-L 1水平升高可能與新生兒窒息后腦損傷發生及嚴重程度有關。Li等[13]研究報道，農藥中毒后病人血清UCH-L 1升高，檢測血清UCH-L 1濃度有助于預測農藥中毒后認知功能障礙發生。Carlos等[14]研究發現，促炎因子IL-1β可能通過介導UCH-L 1參與的泛素化過程，影響阿爾茨海默病發生發展。提示本研究中新生兒窒息后腦損傷時可能增加腦組織炎癥反應，促進神經元釋放UCH-L 1進入血液，影響病兒血清UCH-L 1水平升高。

GFAP是一種主要表達于星形膠質細胞的Ⅲ型中間絲狀蛋白，對神經和星形膠質細胞形態功能維持有重要作用。有研究報道，阿爾茨海默病模型大鼠海馬組織中GFAP表達水平上調，與神經功能發生障礙后星形膠質細胞細胞活性提高及增殖有關[15]。錢紅等[16]研究證實，腦出血后腦損傷大鼠腦組織中GFAP表達水平升高，降低GFAP表達可減輕腦損傷。本研究結果顯示，對照組、輕度窒息組、重度窒息組血清GFAP水平依次顯著升高，且腦損傷組病兒血清GFAP水平明顯高于無腦損傷組病兒，與NBNA評分呈負相關，提示GFAP水平異常升高可能與新生兒窒息后腦損傷發生發展有關。沈露等[17]研究發現，癲癇部分性發作患者血清GFAP水平明顯高于對照組，GFAP水平下調預示患者病情好轉。Shu等[18]研究表明，腦膜腦脊髓炎患者腦組織中GFAP高表達，與細胞炎性反應增加有關。GFAP與膠質細胞活性和遷移能力密切相關，Feng等[19]研究表明，視網膜受損時GFAP水平上調，激活小膠質細胞，促進炎癥因子IL-1β介導的級聯反應。提示本研究中GFAP可能通過影響星形膠質細胞增殖、促進腦組織中炎癥反應發生，參與新生兒窒息后腦損傷進展。

進一步研究發現，低1 min Apgar評分、低NBNA評分、高UCH-L 1水平、高GFAP水平是影響新生兒窒息后腦損傷發生的獨立危險因素。UCH-L 1與GFAP聯合預測新生兒窒息后腦損傷的曲線下面積為0.876，靈敏度為89.60，特異度為88.00%。二者聯合診斷價值較高，可能作為預測新生兒窒息后腦損傷發生的生物標志物。

綜上所述，窒息新生兒血清UCH-L 1、GFAP水平顯著升高，與窒息程度及腦損傷發生有關。血清UCH-L 1、GFAP可作為生物標志物，對新生兒窒息后腦損傷有一定診斷價值。但由于本研究樣本量有限，因子具體作用機制還需增大樣本量全面深入研究。