酒精性肝炎病人血清微小核糖核酸-182和微小核糖核酸-30e檢測及臨床意義

李藝明，鄧倩曦

酒精性肝炎是指長期過量飲酒所致的肝臟炎癥反應性疾病，可隨著疾病的發展出現肝硬化、肝衰竭等，危害甚重。據統計[1]，我國酒精性肝病的患病率約為4.34%，其中酒精性肝炎、酒精性肝硬化分別為1.51%、0.68%，且酒精性肝炎伴肝硬化病人預后差，5年生存率僅為40%左右，因此需對酒精性肝炎病人明確診斷、及早治療。當前臨床上常用的酒精性肝炎指標主要包括肝功能、肝纖維化指標等，但均缺乏特異性，且臨床意義有限。微小核糖核酸（miR）-182定位于人類7號染色體（7q32.2），可與miR-96、miR-183形成基因簇，可以調節生物體的生長、發育及分化，并且與視力、聽力和中樞神經系統障礙等疾病發生關系密切[2-3]。研究指出[4]，miR-182與酒精依賴有相關性，且與肝細胞癌、肝硬化等也有緊密關聯。miR-30e可靶向調控自噬相關基因，與生物體的代謝、腫瘤的生長等均有密切關聯。有研究指出[5]，非酒精性脂肪肝病人中外周血miR-30e水平偏低，且對肝癌也有診斷價值。但目前關于酒精性肝炎病人血清miR-182和miR-30e水平檢測及意義尚鮮有報道。為探討上述問題，本研究分別對98例酒精性肝炎病人和89例健康志愿者的資料展開回顧性分析，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年1月至2019年10月綿陽市第三人民醫院收治的酒精性肝炎病人98例為觀察組，選取同時間段綿陽市第三人民醫院體檢中心體檢的健康志愿者89例為健康對照組。觀察組男81例、女17例，年齡（45.26±8.46）歲，范圍為33～68歲，體質量指數（22.14±2.16）kg/m2，范圍為17.65～27.85 kg/m2，其中有27例并發酒精性肝硬化，肝硬化代償期20例、失代償期7例，其中初診21例，所有病人均接受常規保肝、護肝治療；健康對照組男76例、女13例，年齡（46.75±9.05）歲，范圍為30～70歲，體質量指數（22.16±2.14）kg/m2，范圍為17.61～27.89 kg/m2。兩組性別、年齡及體質量指數比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 納入與排除標準納入標準：①觀察組均符合《酒精性肝病診斷標準》中酒精性肝炎的診斷標準[6]，健康對照組均為健康志愿者；②均檢測外周血血清miR-182和miR-30e水平；③均對本研究知情同意，簽署知情同意書。排除標準：①原發性或轉移性肝癌、肝血管瘤等其它類型肝病者；②合并乳腺癌、肺癌等惡性腫瘤者；③存在其它類型可能與miR-182和miR-30e異常表達有關的疾病者，如視力、聽力和中樞神經系統障礙等；④存在認知、精神、溝通等方面障礙者。

1.3 血清miR-182和miR-30e水平檢測（1）試劑和儀器：美國Beckman Coulter公司Avanti型臺式離心機、日本三洋公司MDF-U54V型醫用超低溫冰箱，美國Invitmgen公司miR easy Mini kit試劑盒，美國GeneCopoeia公司miR逆轉錄試劑盒，美國Bio-Rad公司SC46-T100型PCR儀；（2）檢測方法：取外周血各5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液保存于-80℃的醫用超低溫冰箱中。利用miR easy Mini kit試劑盒抽提血清RNA，并采用miR逆轉錄試劑盒將其逆轉錄為cDNA，合成相應的Taqman熒光探針。以PCI儀進行擴增反應，其中miR-182引物序列正向引物：GCGCTGCTAGACTCTCTGAAT，反向引物：GCTCGATAGCTATTAGCTATAGCTA；miR-30e引物序列正向引物：CGATATAGACTAGCTAGAGAGCTAG，反向引物：CGTGATAGAGAGCTAGAGCGCGCGATAGC，內參為U6，引物均根據GenBank人類信息利用Primer5.0軟件設計，委托寶生物（大連）科技有限公司合成。反應條件：95℃10 min（預變性）、95 ℃20 s（變性）、58 ℃60 s（退火）、72 ℃40 s（延伸），40個循環。繪制PCR曲線，得到Ct值，即熒光強度達到的閾值所需的循環數，待測基因的相對表達量計算方法：2-△△Ct。

1.4 觀察指標比較觀察組與健康對照組及觀察組中未并發酒精性肝硬化、并發酒精性肝硬化、酒精性肝硬化代償期、酒精性肝硬化失代償期病人血清miR-182和miR-30e水平。

1.5 統計學方法數據處理以SPSS 25.0軟件，采用±s描述計量資料，兩獨立樣本間均數的比較采用成組t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組和健康對照組血清miR-182和miR-30e水平對比觀察組血清miR-182和miR-30e水平均低于健康對照組（P<0.05），見表1。

表1 觀察組和健康對照組血清miR-182和miR-30e水平對比/±s

表1 觀察組和健康對照組血清miR-182和miR-30e水平對比/±s

組別健康對照組觀察組t值P值例數89 98 miR-182 0.65±0.12 0.21±0.04 34.27<0.001 miR-30e 1.58±0.25 0.41±0.08 43.93<0.001

2.2 觀察組中是否并發酒精性肝硬化病人血清miR-182和miR-30e水平對比觀察組中并發酒精性肝硬化病人血清miR-182和miR-30e水平均低于未并發酒精性肝硬化病人（P<0.05），見表2。

表2 觀察組中是否并發酒精性肝硬化病人血清miR-182和miR-30e水平對比/±s

表2 觀察組中是否并發酒精性肝硬化病人血清miR-182和miR-30e水平對比/±s

并發肝硬化是否t值例數27 72 P值miR-182 0.13±0.03 0.24±0.05 10.71<0.001 miR-30e 0.29±0.04 0.45±0.10 8.06<0.001

2.3 并發酒精性肝硬化代償期、失代償期病人血清miR-182和miR-30e水平對比并發酒精性肝硬化失代償期病人血清miR-182和miR-30e水平均低于代償期病人（P<0.05），見表3。

表3 并發酒精性肝硬化代償期、失代償期病人血清miR-182和miR-30e水平對比/±s

并發酒精性肝硬化失代償期代償期t值P值例數7 20 miR-182 0.06±0.02 0.15±0.04 5.66 0.000 miR-30e 0.13±0.03 0.35±0.05 10.89 0.000

3 討論

酒精性肝炎主要由于長期過量飲酒所致，且與個體對乙醇的敏感性有關。研究指出[7-9]，長期飲酒不僅可引起肝臟內良性脂肪堆積，還可增加肝組織鐵負荷量，引起機體防御機制失調，誘導氧化應激和脂質過氧化損傷，誘發炎癥和纖維環，在“初次打擊”和“二次打擊”的作用下可導致肝臟炎癥反應損害，損傷肝臟細胞的結構和功能。酒精性肝炎病人若得不到及時診治，可發展為酒精性肝硬化，增加死亡幾率，尤其是在酒精依賴、成癮病人中酒精性肝硬化和死亡的發生風險均更高[10]。但目前人們對酒精性肝炎及酒精性肝硬化的發生和發展認識尚淺，而miR在此類疾病中的異常表達及作用機制雖有少量報道，也仍需要繼續深入探討。

miR-182已均被證實在原發性肝癌病人中表達水平偏低，且與病情程度、肝功能均有密切關系[11]。miR-182可以與靶基因的啟動子、5’UTR結合發揮作用，其作用復雜，且基因簇也很多，在細胞增殖、發育、分化、代謝和凋亡過程中均積極參與且發揮重要的作用。有研究顯示[12]，慢性低濃度酒精攝取可以下調小鼠小腦miR-182的表達水平，且可引發酒精依賴，并誘導中樞神經系統炎癥反應損害，甚至可導致認知功能障礙，推測該基因表達有助于位置神經元的正常結構和功能，而長期過量飲酒可通過下調該基因的表達從而誘導炎癥性損傷。因此miR-182在酒精性肝炎病人中的表達水平也可能顯著下調，且參與肝臟結構與功能的損害，影響肝功能，但是其作用機制均尚未清楚，仍需深入探討和挖掘。本研究中觀察組血清miR-182的水平明顯低于健康對照組，提示酒精性肝炎病人中血清miR-182水平較低。此外，本研究中還顯示并發酒精性肝硬化病人的血清miR-182水平低于未并發病人，且失代償期病人血清miR-182水平低于代償期病人，可知酒精性肝炎病人血清miR-182水平很可能與疾病發展有關，推測很可能是長期過度飲酒導致miR-182表達水平下調，進而誘導肝細胞損傷，且其水平表達水平越低，肝細胞炎癥反應性損傷越嚴重，肝功能損害也越嚴重，故而并發酒精性肝硬化的風險越高，病情進展也越快。

miR-30e是miR-30的一個重要成員，可通過堿基互補配對方式與靶基因相結合，抑制靶基因的表達，進而調控細胞的生長、增殖、分化與凋亡，最終可實現調控機體生長發育和代謝的作用[13]。miR-30e在心血管系統、代謝性疾病以及腫瘤的發生和發展過程中均扮演著重要的角色，其主要作用機制有誘導細胞自噬、誘導氧化應激反應、調控脂肪細胞形成等，在炎癥反應病理改變中也發揮著重要的作用[14]。有研究顯示[15]，miR-30e可協同其家族成員共同參與肝臟炎性損傷的發生和進展，在肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌病人中均發現其表達水平顯著下調。另有研究[16]顯示血清miR-30e低表達可參與慢性肝病的發生和發展，且其水平越低意味著肝臟損傷越嚴重，病人的預后則越差。據此可以推測miR-30e很可能能夠通過多種途徑參與肝損傷病理改變，在酒精性肝炎發生及發展過程中也可能通過影響肝臟內脂肪細胞的形成與積聚、肝細胞的炎癥性損傷和肝臟的代謝功能等發揮重要作用。本次研究中觀察組血清miR-30e水平遠低于健康對照組，提示酒精性肝炎病人血清miR-30e水平普遍偏低。此外，本研究中觀察組并發酒精性肝硬化病人血清miR-30e水平低于未并發病人，且酒精性肝硬化失代償期病人血清miR-30e水平低于代償期病人，可知該指標不僅可評價酒精性肝炎的發生情況，對是否并發酒精性肝硬化、酒精性肝硬化的臨床分期判斷也有一定的指導作用，但其中具體的作用機制仍有待深入探討。

綜上，在酒精性肝炎病人中血清miR-182、miR-30e水平較健康人群偏低，且并發酒精性肝硬化病人中其水平更低，酒精性肝硬化失代償期其水平也明顯低于酒精性肝硬化代償期病人，二者水平與該病的發生和發展有密切關系。但目前人們關于miR-182、miR-30e異常表達參與該病發生和發展的具體機制認識尚淺，仍需深入探討研究，以期為該病的防治提供新的方向。