微小RNA-20a、微小RNA-92a在乳腺癌診斷及預后評估中的應用

羅思佳，袁野，張建新，金煒東

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一。在我國，乳腺癌的發病率呈上升趨勢，并且呈現年輕化現象，嚴重威脅女性生命健康。由于乳腺癌的早期癥狀不明顯，容易出現漏診或誤診，確診時往往處于中晚期[1]，因此，對乳腺癌病人的早期診斷以及尋找新型的非侵入性分子標志物監測乳腺癌病情變化及判斷預后意義深遠。微小RNA（miRNA）是一類非編碼小分子RNA，研究發現，其在多種腫瘤中具有類似癌基因或抑癌基因的作用，且在疾病過程中的不同時期血清樣本獲取簡單[2]，因此，血清miRNA作為腫瘤無創診斷及預后分子標志物的研究是一個重要的研究方向。miR-20a和miR-92a均是miR-17-92基因簇中的重要成員。目前，研究者們已在胃癌、膀胱癌和宮頸癌等多種腫瘤病人血清中發現miR-20a和miR-92a表達異常，且其與腫瘤的分化程度、預后等密切相關[3-5]。但二者在乳腺癌中的表達情況至今尚鮮有報道，基于此，本研究通過檢測乳腺癌病人血清miR-20a和miR-92a表達水平，分析其表達與病人臨床病理特征及預后關系，為乳腺癌的診斷、病情監測及預后判斷提供一種新方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012年1月至2013年5月中國人民解放軍中部戰區總醫院首次確診為乳腺癌并行手術治療的89例病人為觀察組，年齡（63.52±8.14）歲，范圍為40～81歲。所有乳腺癌病人術前均未進行任何治療，且符合乳腺癌手術標準，具有完整的臨床病例和病理資料。按2009年國際抗癌聯盟與美國癌癥聯合委員會合作制定的乳腺癌TNM分期第七版標準進行TNM分期，其中Ⅰ期24例，Ⅱ期37例，Ⅲ期28例；有淋巴結轉移35例，無轉移54例。術前均進行血常規、肝腎功能、雙乳雙腋彩超、雙乳鉬靶腹部彩超檢查，排除自身免疫性疾病病人，心臟、腎等重要器官損傷者，合并其他惡性腫瘤以及遠處轉移者。以同時期80例健康女性體檢者作為健康對照組，年齡（65.31±8.51）歲，范圍為39～83歲。病人或近親屬自愿簽署知情同意書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 實驗方法

1.2.1 血清總RNA提取 采集乳腺癌病人術前及術后和健康體檢者清晨空腹靜脈血，置于抗凝管中，離心（4℃，3 500 r/min，10 min）。取上清液?20℃保存備用。使用miRNeasy Serum/Plasma Kit試劑盒（QIAGEN），嚴格按照試劑盒操作說明提取血清總RNA，DEPC處理過的超純水溶解。分光光度計檢測RNA溶液分別在260 nm和280 nm處的吸光值（A），計算RNA的濃度和純度。A260/A280比值>1.8時可用于檢測miR-20a和miR-92a。

1.2.2 逆轉錄 利用逆轉錄試劑盒miScript Ⅱ RT Kit（QIA-GEN）將血清總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄反應體系共20 μL，包括1.5 μL逆轉錄緩沖液（10×），0.15 μL dNTP（10 mmoL/L），1 μL逆轉錄酶，0.19 μL RNase抑制劑，3 μL 逆轉錄引物，5 μL 總RNA，加水補足至20 μL。反應條件：37 ℃，1 h，使活化試劑中的逆轉錄酶充分活化；95℃，5 min，抑制逆轉酶作用。反應結束后，將反應體系置于冰上防止10 min，然后加入200 μL無酶水，充分混勻。分裝后?20℃保存備用。

1.2.3 定量PCR 利用實時定量PCR法檢測miR-20a和miR-92a表達。內參U6正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物 5'-AACGCTTCACGAATTTG-3'；miR-20a正向 5'-UAAAGU-GCUUAUAGUGCAGGUAG-3'，反向引物 5'-GCTAAAGTGCTTATAGTGCAGGT-3'；miR-92a正向引物 5'-GTCTCGTACCGTGAGTAAT-3'反向引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應體系：miRcute miRNA premix（2×）10 μL，Forward primer（10 μmol/L）0.4 μL，Reverseprimer（10 μmol/L）0.4 μL，miRNA 第一鏈cDNA 2 μL，ddH2O至20 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，總計 45 個循環。采用 2?ΔΔCt法，以 U6 為內參計算 miR-20a和miR-92a相對表達水平。

1.3 隨訪對所有乳腺癌病人進行復查或者電話隨訪，隨訪時間為5年，末次隨訪時間截止至2018年5月，病人生存狀態為復發、死亡、存活；復發主要為局部復發、對側新發和遠處轉移。記錄病人局部復發時間、首次轉移時間及死亡時間。

1.4 統計學方法采用統計學軟件SPSS 21.0對數據進行分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗；計數資料用例表示，采用χ2檢驗。Spearman相關性分析血清miR-20a和miR-92a表達相關性，ROC曲線分析miR-20a、miR-92a以及二者聯合檢測對乳腺癌的診斷價值，Kaplan-Meier法分析miR-20a和miR-92a表達對病人5年總生存期（overall survival，OS）影響，logistic回歸分析影響乳腺癌預后的因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-20a和miR-92a表達水平比較與健康對照組比，乳腺癌病人術前血清miR-20a和miR-92a表達水平均顯著升高（P<0.05）。與術前相比，乳腺癌病人術后血清miR-20a和miR-92a表達水平均顯著下降（P<0.05）。見表1。

表1 乳腺癌病人術前及術后和健康對照組血清miR-20a和miR-92a表達水平比較/±s

表1 乳腺癌病人術前及術后和健康對照組血清miR-20a和miR-92a表達水平比較/±s

組別健康對照組觀察組術前術后F值P值例數80 89 miR-20a 1.02±0.08 miR-92a 1.11±0.07 1.76±0.15 1.38±0.12 785.56 0.000 1.83±0.13 1.45±0.11 951.33 0.000

2.2 miR-20a和miR-92a表達與乳腺癌病人臨床病理特征關系分別依據乳腺癌病人術前miR-20a和miR-92a表達水平的平均值將其分為高表達病人和低表達病人。miR-20a和miR-92a表達與乳腺癌病人年齡和腫瘤直徑無關（P>0.05），與病人腫瘤分化程度、TNM分期及淋巴結轉移相關（P<0.05）。見表2。

表2 miR-20a和miR-92a表達與臨床病理特征關系

2.3 乳腺癌病人血清miR-20a和miR-92a表達相關性Spearman相關性分析結果顯示，乳腺癌病人血清miR-20a和 miR-92a表達呈線性正相關（r=0.52，P<0.05）。

2.4 miR-20a和miR-92a水平對乳腺癌病人診斷價值ROC曲線分析結果顯示，miR-20a、miR-92a以及兩者聯合診斷乳腺癌的敏感度分別為77.0%、83.1%、92.1%特異度分別為78.7%、81.2%、90.0%，ROC曲線下面積（AUC）分別為0.807、0.808、0.946。與miR-20a、miR-92a單獨診斷相比，兩盒聯合診斷時敏感度、特異度以及AUC均顯著升高（P<0.05）。

2.5 生存曲線采用Kaplan-Meier法分析乳腺癌病人血清miR-20a和miR-92a與病人OS的影響。miR-20a和 miR-92a低表達病人OS分別為93.24%、94.85%，miR-20a和miR-92a高表達病人OS分別為73.28%、74.57%。miR-20a和 miR-92a低表達病人OS均顯著高于高表達病人（P=0.011、0.007）。

2.6 logistic回歸分析影響乳腺癌預后的因素以病人預后為因變量（復發、存活=1，死亡=0），以miR-20a、miR-92a、年齡、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、淋巴結轉移為自變量進行Logistic回歸分析，其中miR-20a、miR-92a為實測值，年齡：≥60歲=0，<60歲=1，腫瘤直徑：<3 cm=0，≥3 cm=1，分化程度：高分化=0，中分化=1，低分化=2，TNM 分期：Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ 期=2，淋巴結轉移：是=0，否=1。Logistic回歸分析結果顯示，miR-20a和miR-92a、分化程度、淋巴結轉移均是影響乳腺癌病人預后的獨立危險因素（P<0.05）。見表3。

表3 Logistic回歸分析影響乳腺癌預后的因素

3 討論

早發現、早診斷及早治療可改善乳腺癌病人預后，降低死亡率。血清腫瘤標志物的檢測對病人無創傷，具有較好的重復性，并且可在同一時間點對多項指標進行檢測[6]，是腫瘤診斷和隨訪的理想手段。但是，多種腫瘤尤其是實體腫瘤標志物存在敏感度和特異度較低等缺點。因此，尋找合適的腫瘤標志物一直是腫瘤研究領域的熱點之一。miRNA是一類非編碼小分子RNA，長度為21-25個核苷酸，在細胞增殖、分化和凋亡以及個體發育等生命活動中發揮重要作用[7]。miRNA表達廣泛，除了在腫瘤組織中異常表達外，在腫瘤病人血清中也表達異常。研究發現，miRNA與腫瘤的發生、轉移、耐藥等病理過程關系密切，除此之外，miRNA的穩定性非常高，在高溫、過酸、過堿等環境中仍能維持穩定[8]。因此，血清miRNA是理想的腫瘤標志物。

miR-20a是miR-17-92基因簇中的重要成員，位于13號染色體。miR-20a在多種腫瘤中表達異常，且能夠參與多種腫瘤的發生發展，另外通過調控腫瘤細胞的增值、侵襲及轉移等過程而發揮促癌或抑癌的作用[9]。Yang等[10]研究發現，血清 miR-20a水平與胃癌病人年齡、腫瘤分期、分化程度以及淋巴結轉移相關，其高表達的胃癌病人存活率較低，血清miR-20a可作為胃癌診斷、療效評估和預后的分子標志物。Chen等[11]研究發現，宮頸癌病人血清miR-20a的表達水平顯著升高，淋巴結轉移病人miR-20a水平顯著高于未轉移病人，ROC曲線分析顯示miR-20a具有較高的敏感性和特異性，可能是檢測宮頸癌病人淋巴結狀態的潛在生物標志物。本研究結果顯示，乳腺癌病人血清miR-20a水平較健康體檢者顯著升高，miR-20a高表達與腫瘤分化程度，淋巴結轉移等密切相關，提示miR-20a參與乳腺癌的發生、發展過程。ROC曲線分析結果顯示，miR-20a診斷乳腺癌的敏感度為77.0%，特異度為78.7%、AUC為0.807，說明miR-20a對乳腺癌的診斷具有一定價值。miR-20a高表達病人的OS顯著低于低表達病人，是影響乳腺癌病人預后的獨立危險因素，提示miR-20a高表達與病人預后不良相關，可作為乳腺癌預后不良的生物標志物。

血清指標的聯合檢測可提高疾病的診斷率和預后判斷。洪宏等[12]研究發現血清miR-765和CA153聯合檢測對乳腺癌的診斷效能高于單一指標檢測。張文昭等[13]研究發現，早期乳腺癌病人血清中miR-21、miR-195和miR-222表達水平均升高，三種指標的聯合檢測顯著提高乳腺癌診斷的AUC、靈敏度和特異度，對早期乳腺癌有較高的診斷價值，有助于早期乳腺癌的篩查和診斷。miR-92a也是miR-17-92基因簇中的重要成員，在多種腫瘤中表達異常，與miR-20a聯合檢測可能會提高腫瘤的診斷率。仇俊蘭、奉林[14]研究發現，結直腸癌病人血清miR-92a水平較健康對照組顯著升高，結直腸癌肝轉移組血清miR-92a水平顯著高于無轉移組，用于結直腸癌診斷時的靈敏度和特異度分別為75.3%和88.3%，是結直腸癌病人的早期診斷的生物學標志物，其水平上調病人預后較差。Kong等[15]研究發現，宮頸癌病人血清miR-92a的表達顯著高于健康志愿者，晚期宮頸癌病人血清miR-92a表達高于早期病人，ROC分析顯示，miR-92a診斷宮頸癌的靈敏度和特異性分別為69.6%和80.4%，AUC為0.808，血清miR-92a水平可作為宮頸癌診斷的獨立標志物。本研究結果顯示，與健康體檢者相比，乳腺癌病人血清miR-92a水平顯著升高，miR-92a高表達與腫瘤低分化、淋巴結轉移和高TNM分期關系密切，提示miR-92a在乳腺癌的發生、發展過程中發揮重要作用，其高表達可能促進乳腺癌細胞的侵襲和轉移。ROC曲線分析結果顯示，miR-92a診斷乳腺癌的敏感度分別為83.1%、特異度為81.2%、AUC為0.808，具有較高的診斷價值。miR-92a是影響乳腺癌病人預后的獨立危險因素，其高表達病人OS顯著低于低表達病人，提示miR-92a高表達病人的預后較差，可作為乳腺癌預后不良的生物標志物。相關性分析結果顯示，miR-20a和miR-92a表達呈正相關，兩者聯合檢測診斷乳腺癌的AUC、敏感度和特異度均顯著升高，提示miR-20a和miR-92a聯合檢測可提高乳腺癌病人的診斷效能。另外通過logistic回歸分析顯示，miR-20a和miR-92a、淋巴結轉移以及腫瘤分化程度均是影響乳腺癌預后的危險因素，此結果進一步說明血清miR-20a和miR-92a表達水平不僅與乳腺癌發生發展有關，同時也是影響預后的危險因素。

綜上，乳腺癌病人血清miR-20a和miR-92a表達水平均顯著升高，與病人TNM分期、淋巴結轉移相關，聯合檢測兩者血清水平有助于乳腺癌的診斷，可能成為乳腺癌病人預后的分子標志物。進一步深入研究miR-20a和miR-92a在乳腺癌中發揮作用的分子學機制，可能為乳腺癌分子治療提供新靶點。