TOLL樣受體9/激活蛋白-1信號(hào)通路在過(guò)敏性鼻炎中的作用

王駿，李世東，景陽(yáng)，楊穎，朱旭麗，贠勇剛

過(guò)敏性鼻炎為耳鼻喉科常見(jiàn)臨床疾病，隨著生活環(huán)境的改變，發(fā)病率呈逐年增高的趨勢(shì)[1]。且過(guò)敏性鼻炎與其他多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展均密切相關(guān)，研究表明，患過(guò)敏性鼻炎的病人，發(fā)生哮喘的比率明顯高于其他人群[2]。過(guò)敏性鼻炎的機(jī)制復(fù)雜，相關(guān)因素較多。大多研究認(rèn)為，由炎癥遞質(zhì)引發(fā)的免疫細(xì)胞合成的相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）等均參與了過(guò)敏性鼻炎的發(fā)病機(jī)制中[3]。目前認(rèn)為，過(guò)敏性鼻炎是由免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的I型變態(tài)反應(yīng)。TOLL樣受體（TLRs）家族在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，TLRs與相應(yīng)的配體結(jié)合后，能夠通過(guò)相應(yīng)的信號(hào)通路，介導(dǎo)機(jī)體炎癥和免疫反應(yīng)的發(fā)生[4]。激活蛋白-1（AP-1）是支氣管哮喘發(fā)病的關(guān)鍵因子，處于TLR9信號(hào)通路下游。得到證實(shí)，通過(guò)抑制TLR9/AP-1信號(hào)通路能夠有效控制哮喘的發(fā)作[5]。本研究自2019年3—8月研究TLR9/AP-1信號(hào)通路在過(guò)敏性鼻炎中的作用機(jī)制，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組清潔級(jí)健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量200～300 g，購(gòu)于陜西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在安靜、溫暖（18～25℃）、避強(qiáng)光、晝夜光照節(jié)律的實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周后供本研究實(shí)驗(yàn)所用，自由飲水和攝食。為每只SD大鼠編號(hào)，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、干預(yù)組，每組16只。本研究中對(duì)于大鼠的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 實(shí)驗(yàn)組、干預(yù)組大鼠參考文獻(xiàn)[6]中的方法進(jìn)行過(guò)敏性鼻炎大鼠的動(dòng)物模型制備：造模第1天，將卵清蛋白（OVA）0.3 mg、氫氧化鋁30 mg溶于1 mL生理鹽水中，腹腔注射。第15～21天，每日每側(cè)鼻孔滴入4%的OVA 50 μL；1%OVA霧化吸入5 min。末次滴鼻致敏后，1、2、3、6 h觀察大鼠鼻癢、噴嚏、清涕等行為，根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]中記分方法總分大于5分為造模成功。對(duì)照組操作步驟與實(shí)驗(yàn)組、干預(yù)組相同，腹腔注射、鼻滴、霧化吸入均使用生理鹽水。

1.2.2 干預(yù)措施 干預(yù)組造模成功后給予0.05%丙酸氟替卡松0.1 mL滴鼻；實(shí)驗(yàn)組造模成功后給予生理鹽水0.1 mL滴鼻；對(duì)照組給予生理鹽水0.1 mL滴鼻，三組均每日1次，共7次。

1.2.3 標(biāo)本采集 血液標(biāo)本采集：將各組16只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，每組8只，分別于末次干預(yù)后6、12 h采用腹主動(dòng)脈抽血法處死。采集血液后抗凝，離心，采集血清。鼻黏膜組織采集：大鼠處死后，從鼻背正中縫處裂開(kāi)鼻腔，剝離下鼻黏膜組織?70℃凍存。

1.2.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清中TNF-α、IL-4、IgE含量（檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物有限公司）。參考文獻(xiàn)[6]中方法對(duì)鼻癢、噴嚏、清涕進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分越高表明上述癥狀越嚴(yán)重。蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)各組大鼠鼻黏膜組織中CFos、C-Jun表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0軟件分析，正態(tài)計(jì)量資料用±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，多組之間兩兩比較采用SNK-Q檢驗(yàn)的方法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠干預(yù)后血清IgE、IL-4、TNF-α水平比較統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組大鼠干預(yù)后6、12 h的血清IgE、IL-4、TNF-α水平均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。干預(yù)組大鼠，干預(yù)后12 h的血清IgE、IL-4、TNF-α水平均明顯低于干預(yù)后6 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。干預(yù)后6、12 h，實(shí)驗(yàn)組大鼠血清IgE、IL-4、TNF-α水平均明顯高于對(duì)照組，干預(yù)組大鼠血清IgE、IL-4、TNF-α水平均明顯低于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠干預(yù)后血清免疫球蛋白E（IgE）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平比較/±s

表1 各組大鼠干預(yù)后血清免疫球蛋白E（IgE）、白細(xì)胞介素-4（IL-4）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平比較/±s

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與干預(yù)后6 h比較，P<0.05。③與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組干預(yù)組F值P值干預(yù)后12 h 10.04±1.03 18.36±1.16①13.33±1.03①②③19.58<0.01例數(shù)8 8 8 TNF-α/（ng/L）干預(yù)后6 h 32.33±2.26 57.25±5.15①48.53±4.18①③23.01<0.01干預(yù)后12 h 33.12±3.12 57.21±5.21①42.37±3.97①②③18.25<0.01 IL-4/（ng/L）干預(yù)后6 h 56.55±6.08 75.33±7.16①65.12±5.47①③23.14<0.01干預(yù)后12 h 57.35±5.26 74.06±6.53 60.06±8.53②③22.06<0.01 IgE/（IU/mL）干預(yù)后6 h 11.39±1.56 18.65±1.09①15.95±1.02①③20.00<0.01

2.2 各組大鼠干預(yù)后鼻癢、噴嚏、清涕評(píng)分比較統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組大鼠干預(yù)后6、12 h的鼻癢、噴嚏、清涕評(píng)分均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。干預(yù)組大鼠，干預(yù)后12 h的鼻癢、噴嚏、清涕評(píng)分均明顯低于干預(yù)后6 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。干預(yù)后6、12 h，實(shí)驗(yàn)組大鼠鼻癢、噴嚏、清涕評(píng)分均明顯高于對(duì)照組，干預(yù)組大鼠鼻癢、噴嚏、清涕評(píng)分均明顯低于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠鼻癢、噴嚏、清涕評(píng)分比較/（分，±s）

表2 各組大鼠鼻癢、噴嚏、清涕評(píng)分比較/（分，±s）

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與干預(yù)后6 h比較，P<0.05。③與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組干預(yù)組F值P值干預(yù)后12 h 1.125±0.110 2.750±0.116①1.625±1.03①②③9.53<0.01例數(shù)8 8 8鼻癢干預(yù)后6 h 1.125±0.110 2.500±0.150①1.875±0.128①③13.03<0.01干預(yù)后12 h 1.125±0.110 2.250±0.212①1.375±3.97①②③12.21<0.01噴嚏干預(yù)后6 h 1.125±0.110 2.625±0.126①2.250±0.147①③13.17<0.01干預(yù)后12 h 1.125±0.110 2.750±0.132 1.875±0.153②③12.09<0.01清涕干預(yù)后6 h 1.125±0.110 2.875±0.119①2.125±0.102①③10.10<0.01

2.3 各組大鼠鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun表達(dá)水平比較實(shí)驗(yàn)組大鼠鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun灰度值明顯高于對(duì)照組，干預(yù)組大鼠鼻黏膜組織中CFos、C-Jun明顯低于實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表3。圖1。

表3 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）檢測(cè)各組大鼠鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun灰度值/±s

表3 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting）檢測(cè)各組大鼠鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun灰度值/±s

注：①與對(duì)照組比較，P<0.05。②與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.05。

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組干預(yù)組F值P值C-Fos 0.425±0.050 0.850±0.012①0.575±0.047①②10.29<0.01例數(shù)8 8 8 C-Jun 0.425±0.030 0.950±0.052①0.615±0.047①②11.57<0.01

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun表達(dá)

3 討論

TLRs家族在機(jī)體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，能通過(guò)識(shí)別相關(guān)分子誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答的發(fā)生。呼吸道鼻黏膜富含巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等，具有較高水平的TLRs表達(dá)[7]。TLRs與相應(yīng)的配體結(jié)合后，能夠通過(guò)相應(yīng)的信號(hào)通路，介導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，以及免疫細(xì)胞對(duì)外來(lái)抗原的殺傷作用。大量的研究結(jié)論均證實(shí)，TLR受到病原體的刺激后，能夠通過(guò)激活多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[8-10]。AP-1是調(diào)節(jié)細(xì)胞生存和死亡途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等的分泌，參與細(xì)胞的增殖、炎癥等過(guò)程[11]。徐甜等[12]在研究中對(duì)藥物治療過(guò)敏性鼻炎的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，研究結(jié)果顯示，藥物抗過(guò)敏性鼻炎的作用機(jī)制可能與AP-1、腫瘤壞死因子-α等有關(guān)。AP-1處于TLR9信號(hào)通路下游，由C-Jun、C-Fos核蛋白構(gòu)成。已經(jīng)得到證實(shí)，AP-1是支氣管哮喘發(fā)病的關(guān)鍵因子，AP-1的水平與哮喘病人的癥狀嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系[13]。通過(guò)抑制AP-1及其下游因子的釋放和分泌（IgE、IL-4、TNF-α等），能有效控制哮喘的發(fā)作[14]。

過(guò)敏性鼻炎為I型變態(tài)反應(yīng)，是一種Th2偏離性慢性炎癥反應(yīng)。Th2細(xì)胞可通過(guò)分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子促進(jìn)B淋巴細(xì)胞合成IgE，IgE通過(guò)與肥大細(xì)胞與嗜堿性粒細(xì)胞的結(jié)合，釋放組胺、白三烯等多種炎性遞質(zhì)，引起噴嚏、流涕等癥狀的發(fā)生[15]。TNF-α是具有多種生物學(xué)活性細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[16]。本研究中，通過(guò)檢測(cè)各組大鼠血中IgE、IL-4、TNF-α的含量，反映體內(nèi)炎性遞質(zhì)的水平。本研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組、干預(yù)組干預(yù)后的IgE、IL-4、TNF-α水平均明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明上述因子參與了過(guò)敏性鼻炎的發(fā)生。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組IgE、IL-4、TNF-α水平、癥狀評(píng)分均明顯低于實(shí)驗(yàn)組，說(shuō)明經(jīng)過(guò)藥物的干預(yù)，能夠?qū)w內(nèi)炎癥水平和免疫反應(yīng)發(fā)揮一定的抑制作用，能夠明顯改善過(guò)敏性鼻炎的癥狀。

為了進(jìn)一步分析TLR9/AP-1信號(hào)通路在過(guò)敏性鼻炎中的作用，經(jīng)Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組大鼠干預(yù)后鼻黏膜組織中C-Fos、C-Jun的表達(dá)情況。結(jié)果證實(shí)，C-Fos、C-Jun 的表達(dá)情況與 IgE、IL-4、TNF-α的變化基本同步，說(shuō)明TLR9/AP-1信號(hào)通路參與了過(guò)敏性鼻炎的發(fā)病過(guò)程，藥物治療可通過(guò)作用于該信號(hào)通路發(fā)揮有效的治療效果。可見(jiàn)，藥物治療過(guò)敏性鼻炎的機(jī)制與抑制TLR9/AP-1信號(hào)通路及其下游因子的釋放和分泌有關(guān)。