基于免疫基因的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建和驗(yàn)證

潘強(qiáng)，程偉進(jìn)，陳建軍，盧曄芬

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是常見的一種極具侵襲性的顱內(nèi)惡性腫瘤[1]，1 年生存率約為25%，2 年生存率不到5%[2]。多組學(xué)研究表明，GBM是一種在分子水平和臨床上異質(zhì)性明顯的疾病。癌癥基因組圖譜計(jì)劃（TCGA）于2010年構(gòu)建了類似的GBM 分型系統(tǒng)，基于對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的無監(jiān)督聚類，將GBM 分為經(jīng)典型、神經(jīng)原型、神經(jīng)型和間充質(zhì)型，其中間充質(zhì)型GBM 的預(yù)后最差，復(fù)發(fā)率和病死率最高[3]。腫瘤微環(huán)境（TME）廣泛參與癌癥的發(fā)生發(fā)展等過程，TME的免疫細(xì)胞組成常常決定其對(duì)治療的響應(yīng)，而GBM 的TME 處于明顯的免疫抑制狀態(tài)[4]。因此，有必要對(duì)GBM 腫瘤異質(zhì)性特征整合TME進(jìn)行研究，以期從新的視角對(duì)GBM進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和靶向治療。本研究基于GBM 的分子亞型和免疫標(biāo)志基因，通過網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建基于免疫基因的GBM預(yù)后模型（IPSGBM），結(jié)合免疫特征基因和腫瘤異質(zhì)性，納入不同亞型進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備和預(yù)處理 本研究納入3個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集，共包含1 067 例GBM患者。選取中國(guó)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤基因組圖譜（CGGA）中的388 例GBM患者RNA測(cè)序數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練隊(duì)列，TCGA（HGUG133A）（525 例），GEO（Genome Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫中的GSE16011（154 例）作為驗(yàn)證隊(duì)列。從GlioVis（http://gliovis.bioinfo.cnio.es/）數(shù)據(jù)庫獲取GBM 患者的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)數(shù)據(jù)及相應(yīng)的臨床和分子分型信息，見表1。

表1 隊(duì)列的臨床資料

1.2 整合網(wǎng)絡(luò)分析 從Immport 數(shù)據(jù)庫獲取免疫基因列表。使用“RTN”包構(gòu)建免疫基因和靶基因間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)與非間充質(zhì)型GBM 相比，有34 個(gè)免疫基因（|log2 FC|＞1.5，BH-adjusted P＜0.05）和726 個(gè)靶基因（log2 FC＞0.75，BH-adjusted P＜0.01）在間充質(zhì)型GBM 中差異表達(dá)。借助主調(diào)控分析（MRA）方法，通過超幾何檢驗(yàn)測(cè)定了每個(gè)免疫基因調(diào)控單元中上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達(dá)情況。

1.3 構(gòu)建和驗(yàn)證基于免疫基因的GBM預(yù)后模型 通過MRA 篩選出的免疫基因?yàn)殚g充質(zhì)型GBM 的關(guān)鍵調(diào)控因子。結(jié)合這些免疫基因的表達(dá)情況和患者總體生存期，通過Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析構(gòu)建了一種基于免疫基因的GBM 預(yù)后模型（IPSGBM），并對(duì)CGGA 隊(duì)列中的患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)賦分，以平均值為界將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。該模型的計(jì)分方程：風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（0.060 8×STC1）+（0.011 2×PLAU）+（0.000 3×PLAUR）。隨后，通過Kaplan-Meier 分析在其他兩個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集中檢驗(yàn)IPSGBM的預(yù)測(cè)效能。

1.4 功能分析 為比較不同風(fēng)險(xiǎn)組間的免疫生物學(xué)差異，從MSigDB 數(shù)據(jù)庫下載獲取kegg基因集，設(shè)定運(yùn)行參數(shù)為1 000 次隨機(jī)排列，P＜0.05，使用“fgsea”R包進(jìn)行基因集富集分析（GSEA）。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用R 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。使用“l(fā)imma”包完成差異基因分析，比較間充質(zhì)型GBM 和非間充質(zhì)型GBM 間差異表達(dá)的免疫基因和相應(yīng)的靶基因；使用“survivla”包采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)方法，通過Kaplan-Meier 分析比較高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組間的生存差異；相關(guān)性使用Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 整合網(wǎng)絡(luò)分析 經(jīng)過MRA，確定STC1、PLAU 和PLAUR 3 個(gè)免疫特征基因?yàn)殚g充質(zhì)型GBM 的主調(diào)控基因。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)STC1、PLAU 和PLAUR基因和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化通路中的關(guān)鍵基因TGFB1 有關(guān)（r=0.36、0.59、0.59，均P＜0.05），見彩圖3。

圖3 STC1、PLAU 和PLAUR 免疫特征基因與TGFB1 的相關(guān)分析

2.2 IPSGBM 的構(gòu)建和評(píng)估 依據(jù)IPSGBM 的賦分方程，計(jì)算了CGGA 隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。在每個(gè)隊(duì)列中，以風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的平均數(shù)為閾值，將患者分為高危組和低危組。在CGGA隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中，高危組的總體生存期低于低危組（風(fēng)險(xiǎn)比=1.36、1.42、1.55，均P＜0.05），見彩圖4。

圖4 不同風(fēng)險(xiǎn)組的生存差異

2.3 功能分析 GSEA結(jié)果顯示，TGF-、EMT、黏著斑激酶等信號(hào)通路在高危組中顯著上調(diào)，見彩圖5。

圖5 集富集分析結(jié)果

3 討論

GBM 是一種難治性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，極具侵襲性且預(yù)后較差，中位生存期僅15 個(gè)月[5]。GBM 可分為4 種分子亞型（神經(jīng)原型、神經(jīng)型、經(jīng)典型和間充質(zhì)型），其中間充質(zhì)型GBM 富含巨噬細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，炎癥反應(yīng)活躍，與其他亞型相比，臨床預(yù)后最差[3]。大量證據(jù)表明，免疫特征基因可作為評(píng)估患者臨床轉(zhuǎn)歸和治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物[6-8]。本研究通過整合間充質(zhì)亞型GBM 的免疫特征基因和分子模式進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建基于免疫基因的GBM 預(yù)后模型。

本研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)型GBM 的3 個(gè)主調(diào)控免疫基因（STC1、PLAU、PLAUR），單個(gè)基因即有較好的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。這3 個(gè)基因廣泛參與免疫應(yīng)答，如STC1 涉及TME 的調(diào)節(jié)，在肺腺癌中腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞表達(dá)的STC1 產(chǎn)物調(diào)控腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分化[9]。有研究表明，在食道鱗狀細(xì)胞癌[10]、結(jié)直腸癌[11]及肝細(xì)胞癌[12]中STC1 高表達(dá)水平與患者較差的生存期相關(guān)。據(jù)報(bào)道，PLAU 抑制輔助性T細(xì)胞[13]，且在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[14]，PLAU高表達(dá)與肺鱗癌較差的預(yù)后相關(guān)[15]。PLAUR 影響腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，是惡性腫瘤預(yù)后的不良因素[16]。

IPSGBM 是一種可靠的GBM 預(yù)后模型，由此定義的低危組患者相對(duì)高危組患者總體生存率顯著改善。本研究GSEA 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高危組中間充質(zhì)特征相關(guān)的如TGF、EMT、黏著斑等信號(hào)通路顯著上調(diào)。

盡管構(gòu)建的IPSGBM 能在GBM 患者預(yù)后預(yù)測(cè)中發(fā)揮較好作用，但本研究尚存一些局限性。首先，本研究是一項(xiàng)回顧性分析，納入的數(shù)據(jù)集來源于公共數(shù)據(jù)庫中高通量測(cè)序產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，價(jià)測(cè)序費(fèi)用昂貴、數(shù)據(jù)前處理繁瑣，不利于其在臨床一線的推廣應(yīng)用，而隊(duì)列中的某些患者可能罹患基礎(chǔ)性疾病、急慢性感染或服用抗炎藥物，對(duì)研究產(chǎn)生干擾，因此有待更多的前瞻性隊(duì)列驗(yàn)證。其次，本研究中的所有數(shù)據(jù)集都來自單個(gè)測(cè)序平臺(tái)，提出的IPSGBM 是否也適用于其他測(cè)序平臺(tái)解析出的表達(dá)譜數(shù)據(jù)仍未清楚。最后，需要設(shè)立統(tǒng)一的風(fēng)險(xiǎn)閾值以促進(jìn)該模型的臨床應(yīng)用。未來需要納入多中心的臨床樣本，進(jìn)一步探究該模型的內(nèi)在生物學(xué)功能。