陰道微生態改變與高危人乳頭瘤病毒感染的關系研究

沈彩糯，王巧亞，洪威陽，陳志勇

有研究顯示長期持續感染高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）會直接導致子宮頸癌的發生和發展[1]，而針對HPV的感染和清除機制目前尚無明確的定論。基于陰道內部環境的微生態結構改變和宮頸HR-HPV 感染均可引起陰道優勢菌群的減少及陰道自凈能力的下降[2]。由此，本研究觀察陰道內部環境的微生態結構改變與宮頸HR-HPV持續性感染的相關性，為宮頸癌預防和治療方面提供一種新的思考方向，也為后續宮頸HR-HPV的診治及研究提供新的理論依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019 年1 月至2020 年10 月就診于寧波市奉化區人民醫院婦科門診以及向社會招募的共計300 名婦女。根據HR-HPV DNA 檢測結果分為兩組，觀察組為HR-HPV DNA陽性（150 例），對照組為HR-HPV DNA陰性（150 例），收集兩組陰道毛滴蟲病（TV）、外陰陰道假絲酵母菌病（VVC）、陰道pH 值、白細胞酯酶濃度、唾液酸苷酶濃度、過氧化氫濃度、陰道清潔度及線索細胞陽性等情況。本研究項目已經獲得醫學倫理委員會審批。

1.2 入組及剔除標準 入組標準：（1）既往無抗HPV 治療及疫苗接種史；（2）檢查前3 d 內無性生活、未進行陰道內治療及操作；（3）知情同意。剔除標準：（1）絕經期女性；（2）處于妊娠期及哺乳期；（3）近期接受性激素、免疫抑制劑及抗生素等藥物治療；（4）有惡性腫瘤手術及放化療病史；（5）月經不規律或近半年內有異常陰道出血病史；（6）既往有宮頸治療或錐切、子宮全切及次切術史；（7）患有慢性腎病、糖尿病及高血壓等全身性重大疾病史，或者有自身免疫性疾病；（8）有HPV 疫苗接種史。

1.3 方法

1.3.1 標本采集方法（1）陰道分泌物采樣：于月經干凈1 周內，囑研究對象排空膀胱后躺于檢查床上，擺成膀胱截石位，放入陰道窺陰器，充分暴露宮頸，拿2根無菌衛生棉拭子，將陰道側壁上1/3 處的陰道分泌物沾取后放入已標記上研究對象編號的試管中，盡快送化驗室進行后續檢測。（2）HPV DNA 檢測采樣：采用專屬HPV采樣刷子，在宮頸管位置上，沿著同一個方向反復旋轉3～5 次后取出，將已經采樣的刷子頭直接浸入已標記上研究對象編號的專用保存液中，于4℃冰箱中保存，盡快行后續檢測。

1.3.2 檢測方法及指標（1）檢測陰道清潔度：于載玻片上均勻涂抹采集到的陰道分泌物，進行相應處理后行革蘭染色，高倍顯微鏡下根據不同菌群集落進行分組，再按照陰道清潔度標準分級，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ度。（2）檢測陰道病原體：將采集的陰道分泌物其中一根無菌棉拭子均勻涂抹在滴了一滴0.9%氯化鈉注射液的載玻片上，于常規倍數顯微鏡下查找陰道毛滴蟲、真菌孢子或菌絲、線索細胞等病原體。找到陰道毛滴蟲即可診斷為TV；找到真菌孢子或菌絲，可診斷念珠菌性VVC；檢測出線索細胞，可診斷細菌性陰道病（BV）。（3）檢測陰道分泌物酶學指標：將另一根采集的陰道分泌物無菌棉拭子進行光化學酶法試驗，使用快速BV 檢測試劑盒對標本進行功能酶學顯色觀察。pH 值正常范圍為3.8～4.4，pH 值＞4.5 為陽性；對應檢測唾液酸苷酶的框顯紅色或紫色為陽性；對應檢測過氧化氫的框顯藍色為陽性，顯出紅色或紫色為陰性；對應白細胞酯酶的框顯藍色或綠色為陽性；其中一項或多項陽性，即提示陰道炎癥存在[3]。（4）HR-HPV 分型檢測采用凱普PCR 導流膜雜交法，同時檢測包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58 等分型。

1.4 統計方法 采用SPSS 27.0 統計軟件進行分析，計數資料采用檢驗，多因素分析采用Logistic 回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組陰道微生態各項指標比較觀察組TV、VVC、pH、白細胞酯酶、唾液酸苷酶、過氧化氫、陰道清潔度及線索細胞陽性率均高于對照組（均P＜0.05），見表1。

表1 兩組陰道微生態各項指標比較 例（%）

2.2 多因素分析 TV、VVC、白細胞酯酶、唾液酸苷酶、過氧化氫、陰道清潔度、細索細胞、陰道pH值均是宮頸HR-HPV感染的危險因素（均P＜0.05），見表2。

表2 陰道微生態指標與宮頸HR-HPV 的多因素分析

3 討論

宮頸癌與宮頸HR-HPV的持續感染關系密切，然而并不是所有感染了HPV的女性均會發展為宮頸癌，大部分女性感染HPV 后可在短暫或間歇感染后逐漸被清除，一般時間為8 個月至2 年。而國內外目前關于宮頸HR-HPV感染的機制還處于病因學研究的階段。有研究提出陰道乳酸桿菌減少，以及加德納菌或混合性厭氧菌大量繁殖，產生了許多有害的代謝產物，聯合作用于宮頸，可以加速宮頸癌的發生發展[3]。由此可以聯想到以乳酸桿菌減少為主要表現的各種陰道內部環境的微生態改變與宮頸HRHPV 感染后進展為宮頸浸潤癌必然存在一定的相關性。已有多項研究發現BV、TV、VVC 是宮頸HR-HPV 感染的高危因素[4-5]，本研究結果與之相似。

正常的陰道內環境中共存活300 多種微生物，包括多種厭氧菌和需氧菌，其中最為重要的當屬乳酸桿菌，在健康女性的陰道分泌物標本中可分離出高達50%～80%的乳桿菌。陰道內部環境中各種菌群之間互相協調，互相制約，使得陰道內微生態環境保持相對穩定。陰道內存在的這些正常菌群可以維持陰道局部環境處于一種弱酸性狀態，pH值為3.8～4.5。弱酸性環境可以很好地抑制陰道內其他致病微生物病原體的生長繁殖；另外乳酸桿菌還可以通過競爭、黏附和替換等方式阻止陰道內致病微生物病原體的聚集、黏附和生長，從而在預防陰道炎癥性疾病中發揮重要的陰道自凈作用[6]。

BV 是以線索細胞增生為主要表現的陰道炎性疾病，其陰道內雜菌數量明顯增多，乳酸桿菌數量明顯下降，陰道內部菌群數量及種類失衡。乳酸桿菌的減少使得陰道內乳酸減少，陰道pH 上升，過氧化氫減少，從而陰道自凈能力進一步下降，便于致病微生物病原體（包括衣原體、支原體、細菌、HPV 病毒等）進一步侵入，加重陰道局部炎癥反應。TV 是感染陰道毛滴蟲所致的陰道炎性疾病。陰道毛滴蟲通過吞噬或消耗陰道上皮細胞內的糖原，從而阻礙正常菌群產生乳酸，導致陰道內環境pH 值上升，破壞陰道內環境的弱酸性狀態，從而使得陰道內環境狀態更便于其他雜菌或致病微生物的侵入和生長繁殖。另外陰道毛滴蟲還能夠消耗氧氣，形成一種厭氧的環境，更加不利于陰道內環境中乳酸桿菌的生長繁殖，反而導致了厭氧菌的增殖。VVC主要是白色假絲酵母菌感染，正常情況下人體也可攜帶，為條件致病菌，在無癥狀寄居及傳播中起作用的是酵母相，可檢測出真菌孢子；而具備侵襲組織能力的為菌絲相，可檢測到真菌菌絲。正常健康狀態下，假絲酵母菌的生長和繁殖受到乳酸桿菌的抑制，而一旦乳酸桿菌的數量缺乏或減少，則會增加VVC的發生。VVC 的感染使得陰道內上皮組織的通透性增強、產生侵襲性酶、上皮細胞損傷、陰道防御屏障損傷和菌群失調，導致陰道內炎癥的蔓延和加重，有利于其他致病微生物的侵入。而HPV 病毒是一種嗜好侵入上皮組織內的無包膜的環狀雙鏈DNA病毒，感染后可以導致宮頸及陰道的上皮細胞發生病變，從而減弱陰道的物理屏障作用，也使得局部細胞的免疫功能受到影響，進一步加重陰道內環境微生態紊亂程度[7]。本研究結果進一步證實了BV、TV、VVC與宮頸HRHPV 的感染存在密切關系。

有學者研究后提出結合陰道分泌物的常規鏡檢和功能酶學檢測在陰道微生態早期改變的診斷中有一定的指導意義，借助功能酶學多個項目的聯合分析可以更全面的了解陰道微生態情況[8]。pH值＞4.5 提示陰道內弱酸性狀態遭到破壞，更利于陰道內雜菌的增生繁殖，而相應的乳桿菌數目就會減少且功能減弱，這提示陰道內環境可能處于炎癥狀態。白細胞酯酶是白細胞裂解釋放的物質，其陽性反應表明陰道中性粒細胞存在且數量增多，即存在陰道炎癥可能。唾液酸苷酶通過分解糖蛋白中的唾液酸來降解黏液，從而防止生殖道潛伏的病原體與陰道上皮細胞的直接接觸，在促進鱗狀上皮細胞剝脫及厭氧菌黏附在陰道表面時唾液酸苷酶均具有重要的作用，陰道黏膜物理保護屏障的受損與破壞可導致生殖道病原體感染率的增加。通過檢測過氧化氫濃度可用于評價乳酸桿菌數目和功能。過氧化氫濃度升高側面反映了乳酸菌數目和功能的下降，提示陰道內微生態處于失衡狀態。陰道清潔度異常表明陰道內菌群的多樣性和密集性增加，提示陰道可能存在感染。本研究結果顯示觀察組pH 值、白細胞酯酶、唾液酸苷酶、過氧化氫、陰道清潔度及線索細胞陽性率均高于對照組（均P＜0.05），這進一步從陰道功能酶學的層面上證實了宮頸HR-HPV 感染與陰道內環境微生態結構改變具有相關性。