右美托咪定對老年小鼠海馬和杏仁核半胱氨酸蛋白酶-3基因表達影響的實驗研究

鄭 凌，張霞靖，劉 倩

(西安市人民醫院 西安市第四醫院麻醉科，陜西 西安 710004)

當機體出現老化時，其可導致機體出現意識水平、精神狀況、注意力的下降，并且可長期存在與反復發作，從而影響患者生活質量的下降，誘發老年癡呆的發生[1-2]。降低老年人認知功能障礙的發生率，可有效延長老年人的生活質量[3]。在顱內腦組織中，海馬和杏仁核組織是學習、記憶等高級神經活動的重要部位，特別是認知功能障礙患者的海馬和杏仁核組織可受到傷害，可直接影響去甲腎上腺素能和多巴胺能神經的含量，導致機體出現學習、記憶功能障礙。右美托咪定(Dexmedetomidine，DEX)是一種高選擇性的α2受體激動劑，可導致交感神經系統遲鈍，可抑制去甲腎上腺素的釋放，從而產生抗焦慮、鎮靜、鎮痛等作用[4-5]。同時其也可通過激活藍斑核α2腎上腺素受體，模擬“自然睡眠”效應，產生劑量依賴性鎮靜作用，當前在臨床上的應用比較多見[6]。有研究顯示激活α2腎上腺素受體的表達可影響大鼠在水迷宮中的空間導航能力，而阻滯該受體的表達則可增強大鼠的記憶能力[7]。還有研究顯示右美托咪定可與通過下丘腦腹外側視前區神經元環路下游γ-氨基丁酸受體進行結合，從而發揮鎮靜作用[8]。并且右美托咪定可在神經系統遭受創傷時抑制機體的炎癥反應，降低老年患者術后認知功能障礙，調節細胞凋亡并減少氧化應激反應[9]。本文具體探討了右美托咪定對老年小鼠海馬和杏仁核半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)基因表達的影響，以明確右美托咪定的作用效果與機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 48只老年(18月齡)SPF級健康雄性SD小鼠(體重400～550 g)購自北京維通利華實驗動物有限公司，并飼養于本院動物實驗中心的SPF級動物房(合格證批號:23981333)。所有小鼠可自由進食進水，在標準飼養環境進行飼養，自然晝夜光線照明，室溫18～22 ℃。操作過程符合動物倫理要求，通風良好，研究也得到了本院倫理委員會的批準。

右美托咪定購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司(國藥準字:H20090248)，抗β-actin抗體、蛋白裂解液、蛋白定量試劑盒等購自上海碧云天生物技術有限公司，Caspase-3抗體購自Abcam公司，舒芬太尼購自宜昌人福藥業有限責任公司(國藥準字:H20054171)，小動物麻醉劑與無菌縫線購自美國Sigma公司。ZH0065型Morris水迷宮視頻分析系統購自北京碩林苑科技有限公司，Caspase-3基因檢測試劑盒購自中國軍事醫學科學院，血清去甲腎上腺素試劑盒、腦血紅蛋白購自Cusabio公司。

1.2 研究方法

1.2.1 小鼠分組與干預：將所有小鼠隨機平分為三組：對照組、舒芬太尼組與右美托咪定組，所有大鼠給予正常飼養。舒芬太尼組與右美托咪定組：分別給予5 μg/kg舒芬太尼與5 μg/kg右美托咪定進行腹腔注射。對照組：給予等容量0.9% 氯化鈉溶液腹腔注射。每周1次，持續8周。

1.2.2 觀察指標： ①所有大鼠在干預第4周與第8周進行水迷宮實驗，實驗開始前1 d訓練小鼠站臺，實驗期間保持安靜無人的實驗環境，正式實驗開始后記錄小鼠在120 s內的逃避潛伏期(找到平臺時間)，同時記錄小鼠的穿越平臺次數與處于平臺所在象限時間。采用北京碩林苑科技有限公司的自帶視頻跟蹤軟件輸出小鼠的運動軌跡。②在干預第4周與第8周取小鼠的尾靜脈血0.2～0.5 ml，低溫離心后分離上層血清，采用免疫發光法檢測血清去甲腎上腺素、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。③在干預第8周處死所有小鼠，剝離出完整腦組織后，冰上剝離取出海馬和杏仁核組織，充分研磨后提取總RNA，逆轉錄后采用qPCR法檢測Caspase-3基因表達水平，以β-actin作為基因內參，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。④取上述的小鼠海馬和杏仁核組織，充分研磨后，用蛋白裂解液裂解海馬組織并提取全蛋白，定量蛋白濃度后，取20 μg蛋白樣品進行蛋白電泳并轉膜，以5%脫脂牛奶室溫下封閉30 min，加入抗Caspase-3抗體(稀釋度為1∶2000)，室溫孵育30 min后4 ℃放置過夜，TBST洗膜3×10 min次，然后加入二抗，室溫1 h，TBST洗膜3×10 min次，采用ECL Western Blot Kit 進行暗室顯影，以β-actin為參照，用Image J軟件量化相對灰度值，為此判定目的蛋白的相對表達量。

2 結 果

2.1 三組干預不同時間點水迷宮實驗指標比較 舒芬太尼組與右美托咪定組干預第4周與第8周的逃避潛伏期低于對照組(均P<0.05)，穿越平臺次數與處于平臺所在象限時間高于對照組(均P<0.05)，兩組對比差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 三組干預不同時間點水迷宮實驗指標比較

2.2 三組干預不同時間點血清TNF-α、去甲腎上腺素含量比較 舒芬太尼組與右美托咪定組干預第4周與第8周的血清去甲腎上腺素含量高于對照組(均P<0.05)，TNF-α含量低于對照組(均P<0.05)，兩組對比差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 三組干預不同時間點血清TNF-α、去甲腎上腺素含量比較(pg/ml)

2.3 三組干預第8周海馬和杏仁核Caspase-3基因表達水平比較 舒芬太尼組與右美托咪定組干預第8周的海馬和杏仁核Caspase-3基因表達水平低于對照組(均P<0.05)，見表3。

表3 三組干預第8周海馬和杏仁核Caspase-3基因表達水平比較

2.4 三組干預第8周海馬和杏仁核Caspase-3蛋白表達水平對比 舒芬太尼組與右美托咪定組干預第8周的海馬和杏仁核Caspase-3蛋白表達水平低于對照組(均P<0.05)，見表4。

表4 三組干預第8周海馬和杏仁核Caspase-3蛋白表達水平對比

3 討 論

隨著軀體的老年化，很多老年人伴隨有認知功能障礙，在臨床上的特征為認知功能逐漸下降，各種神經系統的異常。在病理上表現為應激性毒性副產物的蓄積，大腦神經元的減少，使得大腦的應激能力下降[10]。舒芬太尼為臨床上的常見麻醉鎮靜藥物，有利于緩解老年患者的認知功能障礙情況，但是對于老年人有一定的成癮性。右美托咪定雖然能夠致交感神經系統遲鈍，從而產生相應的鎮靜與抗焦慮作用，但是其起效迅速，清除率快且幾乎對呼吸無影響。并且右美托咪定能減輕機體血流動力學紊亂等情況，可抑制多種因素導致的腦組織炎性反應，如缺氧導致的鼠腦損傷、缺血再灌注損傷導致的炎性反應等。本文采用的Morris水迷宮實驗系統配套有電腦系統，可同步自動記錄大鼠運動軌跡及尋找平臺的時間等，更加有利于進行認知功能的判斷。本研究顯示舒芬太尼組與右美托咪定組干預第4周與第8周的逃避潛伏期低于對照組(均P<0.05)，穿越平臺次數與處于平臺所在象限時間高于對照組(均P<0.05)，舒芬太尼組與右美托咪定組對比差異有統計學意義(P<0.05)，表明右美托咪定在老年小鼠的應用能改善認知狀況。當前有研究表明右美托咪定可改善重癥創傷應激小鼠的血腦屏障通透性，從而有利于小鼠的認知功能恢復[11]。本文顯示右美托咪定組第4周與第8周的海馬組織去甲腎上腺素含量都顯著高于對照組(均P<0.05)，說明右美托咪定的應用能有效拮抗海馬內去甲腎上腺素的含量下降情況，使得去甲腎上腺素能投射系統增加，影響下游神經遞質釋放機制。

衡量人類智能發育的重要指標就是學習記憶，去甲腎上腺素是最早被發現的單胺類神經遞質。隨著老齡化的發展，伴隨有海馬去甲腎上腺素含量減少和血清TNF-α含量增加，可使得機體記憶能力受到損傷。右美托咪定能抑制腺苷酸環化酶活性和環磷腺苷(Cyclophosphine adenosine，cAMP)的合成，導致突觸活動減少，產生突觸前抑制，可影響下游神經遞質釋放。右美托咪定也具有抗神經興奮毒性、鎮靜、抑制交感活性、抗炎等多種作用，是臨床上安全有效的麻醉輔助藥品，具有神經元保護作用[12-13]。本研究顯示舒芬太尼組與右美托咪定組干預第4周與第8周的血清去甲腎上腺素含量高于對照組(均P<0.05)，TNF-α含量低于對照組(P<0.05)，舒芬太尼組與右美托咪定組對比差異有統計學意義(P<0.05)，表明右美托咪定在老年小鼠的應用能抑制TNF-α的釋放，提高血清去甲腎上腺素含量。還有研究顯示，作為一種α2-腎上腺素能受體激動劑，右美托咪定具有抗焦慮、鎮靜、鎮痛、催眠等綜合藥理作用，可降低重大創傷術后炎性反應和認知功能障礙的發生[14-15]。

抑制腦組織的細胞凋亡具有保護神經元的功能，右美托咪定可激活位于藍斑核的腎上腺素受體，能抑制腦組織的細胞凋亡，從而降低神經系統后遺癥的發生率[16]。右美托咪定還可抑制小膠質細胞活化，減少麻醉手術后神經細胞的凋亡，下調NF-κB 通路，降低海馬組織TNF-α和IL-1β的表達水平，減少認知功能障礙的發生[17]。本研究顯示舒芬太尼組與右美托咪定組干預第8周的海馬和杏仁核Caspase-3基因、蛋白表達水平低于對照組(均P<0.05)，舒芬太尼組低于右美托咪定組(P<0.05)，表明右美托咪定在老年小鼠的應用能抑制海馬和杏仁核Caspase-3基因、蛋白的表達。還有研究顯示右美托咪定可降低Casepase-3蛋白表達量，從而減少機體麻醉手術后神經細胞凋亡率，從而改善機體的認知功能[18-19]。本研究也存在一定的不足，大鼠數量較少，分組也比較少，也沒有進行劑量分析，機制分析還不明確，將在后續研究中深入探討。

綜上所述，右美托咪定在老年小鼠的應用能抑制海馬和杏仁核Caspase-3基因與蛋白表達，也可抑制TNF-α的釋放，提高血清去甲腎上腺素含量，從而有利于小鼠的認知功能恢復。