脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對小鼠創(chuàng)面組織超氧化物歧化酶及血管內(nèi)皮生長因子、表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響

左 楠，崔 莉，王 爽

(1.西北大學(xué)附屬醫(yī)院 西安市第三醫(yī)院皮膚科, 陜西 西安 710018；2.陜西省人民醫(yī)院皮膚科,陜西 西安 710068；3.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科,陜西 西安710004)

創(chuàng)面愈合一直以來是整形外科和燒傷外科常見的問題，對于較為淺表創(chuàng)面的皮膚全層缺損，可以通過促進(jìn)殘留皮膚附件內(nèi)的干細(xì)胞再生愈合[1]。對于較為深層的創(chuàng)面，臨床上多采用皮瓣移植進(jìn)行修復(fù)。但因?yàn)槠淙〔拇笮∈芟蓿〔暮罂赡軙o供體部位造成負(fù)面影響；且供區(qū)皮膚來源以及免疫排斥問題也限制了其有效的應(yīng)用[2-3]。細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)膠Matrigel是一種可溶性的基底膜基質(zhì)，具有良好的可注射性和組織相容性，包括成纖維生長因子、層黏連蛋白組織纖維酶原活化因子等，可為干細(xì)胞提供不被體內(nèi)退變微環(huán)境損傷的三維支持[4]。干細(xì)胞移植已成為近年來創(chuàng)面再生修復(fù)的研究熱點(diǎn)之一，與其他的干細(xì)胞相比較，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Human adipose dervied stem cells，hASCs)具有容易獲得、獲取效率高、可跨胚層多向分化、獲取過程中造成損傷小、增殖速度快等特點(diǎn)[5-6]。hASCs具有多向分化潛能，也能夠自我復(fù)制，能夠分化為同為中胚層的成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，提示在創(chuàng)面愈合中可能存在重要的價(jià)值[7-8]。本研究探討hASCs促進(jìn)小鼠創(chuàng)面愈合的作用。現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物： 裸鼠24只(6～8周齡，雌性，體重18～22 g，6～8周齡)，購自實(shí)驗(yàn)動物中心(批號：23882814)。于SPF實(shí)驗(yàn)部飼養(yǎng)，室溫控(23±3)℃，相對濕度50%，采用高壓滅菌后的專用裸鼠飼料(北京維通利華有限公司)喂食，飼養(yǎng)在正常晝夜環(huán)境中(光照12 h/d)，飲用水為純凈水。本研究所有動物操作都符合倫理要求，且研究得到了動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：hASCs與Matrigel都由本實(shí)驗(yàn)室保存(批號：7777214、2874888)，胎牛血清、TritonX-100、DMEM 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶等試劑都購自Sigma公司(美國，批號分別為184822、1842662、2876429、3145552)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠創(chuàng)面愈合的建立：采用腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)對裸鼠進(jìn)行全身麻醉，使用75%乙醇消毒裸鼠背部皮膚3遍，并將2個(gè)消毒后的聚酯膠圈(將內(nèi)徑6 mm、外徑10 mm的聚酯膠軟管修剪為厚度為1 mm的聚酯膠圈)置于裸鼠脊椎兩側(cè)的背部皮膚上并固定。全層裸鼠皮膚及其肉膜使用眼科剪沿膠圈內(nèi)側(cè)剪除，并暴露肌肉層，制備出圓形皮膚缺損(2個(gè)直徑4 mm)。創(chuàng)面使用無菌不透水敷料覆蓋，術(shù)后裸鼠單籠飼養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組與處理：把建模后的裸鼠隨機(jī)分為三組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組：將hASCs以1×107的密度接種于Matrigel，調(diào)整hASCs濃度，每只裸鼠注射400 μl(含有1.5×105個(gè)hASCs)。細(xì)胞組：每只裸鼠注射400 μl(含有1.5×105個(gè)hASCs)，不接種于Matrigel。對照組：每只裸鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面處注射400 μl磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)。上述注射治療1次/d，持續(xù)7 d。

1.2.3 觀察指標(biāo)：①在術(shù)后7、14 d觀察創(chuàng)面，創(chuàng)面愈合為新生填充組織填充缺損、創(chuàng)面完整的再上皮化。創(chuàng)面愈合率(%)×[(原始創(chuàng)面面積-檢測時(shí)的創(chuàng)面面積)÷原始創(chuàng)面面積]=×100%。②在術(shù)后7、14 d進(jìn)行創(chuàng)面取材，包括創(chuàng)面中心和周圍皮膚進(jìn)行分析，用組織均漿器制成100 g/L的組織均漿，在-10 ℃ 3500 r/min的條件下離心20 min，采用連苯三酚自氧化法檢測超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)水平，采用硫代巴比妥酸比色法檢測丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平。③術(shù)后14 d處死裸鼠，取眼球血液0.5 ml，分離血清，血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)、表皮生長因子(Epidermal growth factor，EGF)及堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast growth factor，bFGF)表達(dá)水平用酶聯(lián)免疫法檢測。同時(shí)取材后行創(chuàng)面組織切片并行MASON染色。

2 結(jié) 果

2.1 三組不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較 所有裸鼠都造模成功，無動物因麻醉或手術(shù)而死亡。實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞組術(shù)后7 d與14 d的創(chuàng)面愈合率顯著高于對照組，實(shí)驗(yàn)組也顯著高于細(xì)胞組(均P<0.05)，見表1。

表1 三組不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較(%)

2.2 三組不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織SOD與MDA水平比較 對實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞組術(shù)后7 d與14 d創(chuàng)面組織的SOD水平顯著升高，MDA水平顯著降低(均P<0.05)，且實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 三組不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面組織SOD與MDA水平比較

2.3 三組術(shù)后14 d血清細(xì)胞因子表達(dá)水平比較 實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞組術(shù)后14 d的血清VEGF、EGF、bFGF表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)，且實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞組對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 三組術(shù)后14 d血清細(xì)胞因子表達(dá)水平比較(ng/ml)

2.4 三組MASSON染色特征比較 實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面已經(jīng)完全愈合，表皮修復(fù)情況良好，可見部分炎性細(xì)胞浸潤，呈復(fù)層上皮排列。細(xì)胞組：已修復(fù)部分的表皮修復(fù)情況良好，表皮呈復(fù)層上皮排列，仍有部分創(chuàng)面未能愈合，肉芽組織生長良好。對照組：尚未愈合的創(chuàng)口周圍可見有瘢痕組織增生，可見炎性細(xì)胞浸潤較明顯，仍有相當(dāng)一部分創(chuàng)面尚未能愈合(圖1)。

對照組 實(shí)驗(yàn)組 細(xì)胞組

3 討 論

皮膚作為人體最大的器官，覆蓋于全身表面，約占全身體重的16%，含有復(fù)雜的血管和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，有一定的自我修復(fù)功能。皮膚組織大多數(shù)由機(jī)械傷、燒傷和爆炸傷等原因造成，其愈合和修復(fù)涉及多個(gè)因素，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)生成和炎癥反應(yīng)等，是一個(gè)整體且復(fù)雜的過程。以往的組織修復(fù)通過將有創(chuàng)傷的移植方式把相關(guān)移植物植入到體內(nèi)，再進(jìn)行修復(fù)缺損組織，雖然有一定的成功率，但是修復(fù)過程復(fù)雜，在修復(fù)后多伴隨有后遺癥[9-10]。

干細(xì)胞移植已成為近年來創(chuàng)面再生修復(fù)的研究熱點(diǎn)之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等應(yīng)用比較多，但由于上述兩種細(xì)胞涉及取材困難、免疫排斥及法律道德等方面的問題，其應(yīng)用受到了限制[11-12]。hASCs是一類間充質(zhì)干細(xì)胞，存在于脂肪組織中，其具有多項(xiàng)分化潛能，能夠分化為不同胚層來源的細(xì)胞。另外，hASCs是一種較為理想的組織工程種子細(xì)胞，其具有多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)，即不涉及倫理問題、干細(xì)胞得率高、易采集和來源廣等[13-14]。hASCs具有多向分化潛能，是組織修復(fù)良好的種子細(xì)胞，可以向其他胚層來源的細(xì)胞分化，能夠有效提高機(jī)體的愈合能力。但是在干細(xì)胞注射過程中，組織的局部缺血和炎癥反應(yīng)的微環(huán)境等均可造成細(xì)胞增殖活性下降，導(dǎo)致治療效果下降。Matrigel是一種可溶性的基底膜基質(zhì)，內(nèi)含多種細(xì)胞因子，可注射性和組織相容性都較好，可為干細(xì)胞增殖提供三維支持[15]。本研究顯示所有裸鼠都造模成功，無動物因麻醉或手術(shù)而死亡；實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞組術(shù)后7 d與14 d的創(chuàng)面愈合率顯著高于對照組，術(shù)后14 d實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞組的血清VEGF、EGF、bFGF表達(dá)水平顯著對照組(均P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組也顯著高于細(xì)胞組(P<0.05)，說明hASCs接種于Matrigel可促進(jìn)小鼠創(chuàng)面愈合，也有利于細(xì)胞因子的表達(dá)。VEGF、EGF、bFGF可以通過促進(jìn)血漿蛋白在局部沉積為組織再生和新生血管長入提供細(xì)胞外基質(zhì)，能促進(jìn)局部微循環(huán)血管網(wǎng)的建立和成骨細(xì)胞的生長，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞向壞死區(qū)轉(zhuǎn)移。VEGF、EGF、bFGF其表達(dá)水平可有效反映骨組織的生理狀態(tài)，VEGF、EGF、bFGF表達(dá)水平越高，創(chuàng)面愈合能夠越強(qiáng)[16]。從機(jī)制上分析，Matrigel配合hASCs能夠更持久更有效地發(fā)揮；其也可構(gòu)建一種有效的可注射的三維微環(huán)境，減少創(chuàng)面微環(huán)境中因各種因素造成hASCs的流失、凋亡，進(jìn)一步促進(jìn)創(chuàng)面愈合[17-18]。

創(chuàng)面愈合本質(zhì)是創(chuàng)面重建的過程，在此過程中涉及局部微環(huán)境的構(gòu)建、血管的生成等。hASCs來源廣泛，可以從自體或異體獲得，易于分離、培養(yǎng)，經(jīng)過基因技術(shù)加工后生物學(xué)特性也比較好。hASCs也能促進(jìn)血管重建、再上皮化及創(chuàng)面收縮，促進(jìn)肉芽組織沉積，減輕炎癥反應(yīng)，能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞，促使促進(jìn)創(chuàng)面愈合[19]。本研究顯示實(shí)驗(yàn)組與細(xì)胞組術(shù)后7 d與14 d創(chuàng)面組織的SOD水平顯著高于對照組(P<0.05)，MDA水平顯著低于對照組(P<0.05)，且實(shí)驗(yàn)組和細(xì)胞組對比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表明hASCs的應(yīng)用能減輕創(chuàng)面氧化應(yīng)激反應(yīng)。特別是Matrigel配合hASCs可以很大程度的增強(qiáng)創(chuàng)面的修復(fù)能力，能促進(jìn)分泌相關(guān)生長因子，幫助皮膚成纖維細(xì)胞的遷移，也可幫助刺激膠原的分泌和組織，從而增強(qiáng)創(chuàng)面修復(fù)水平[20]。當(dāng)前也有研究將hASCs接種到具M(jìn)atrigel中，當(dāng)形成hASCs/Matrigel復(fù)合物后，移植至裸鼠背部的全層皮膚缺損創(chuàng)面，能夠有效的將hASCs維持在創(chuàng)面的局部微環(huán)境中，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合[20]。本研究也有一定的不足，hASCs也存在一定的免疫排斥性，導(dǎo)致實(shí)際臨床應(yīng)用效果可能不佳；且hASCs/Matrigel復(fù)合物為外源性物質(zhì)，在實(shí)際應(yīng)用中可能受到限制；本研究樣本數(shù)量也不足，將在后續(xù)研究中深入分析。

綜上所述，Matrigel復(fù)合hASCs在小鼠創(chuàng)面中的應(yīng)用能促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌，抑制創(chuàng)面的氧化應(yīng)激作用，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。