建立兔VX2肝癌模型及血管介入操作方法

武自強 魏 寧 周春澤 魯 東

各類無法切除的肝臟惡性腫瘤，往往是晚期癌癥患者的致死原因，控制肝臟腫瘤進展可有效延長生存期。當前，以血管介入為核心的微創診療技術仍是提高肝癌局部控制率的重要選擇。肝動脈化療栓塞術（TACE）、肝動脈化療灌注術（HAIC）和門靜脈栓塞術（PVE）的應用，無論在姑息治療還是轉化橋接治療方面，都取得了肯定的療效。兔VX2肝癌模型是論證介入治療新方法的常用動物模型。本文對本中心既往動物實驗得失進行總結，為初學者展現建立穩定兔VX2肝癌模型和血管介入操作方法細節。

1 材料與方法

1.1 瘤株及實驗動物 兔VX2腫瘤細胞懸液5 mL及健康新西蘭大白兔共80只，均由中國科學技術大學附屬第一醫院動物實驗中心提供（動物檢驗合格證明編號:3203254925）。兔VX2腫瘤細胞懸液以液氮低溫保存。新西蘭大白兔雌雄不限，育齡大于6個月，體質量2.8～3.5 kg，普通飼養于動物實驗中心，10只用于載瘤傳代，70只用于建立肝癌模型或介入操作。本實驗通過倫理委員會審批，編號為：LLSC 20190745。

1.2 建立兔VX2載瘤模型 首先將低溫保存的腫瘤細胞懸液試管置入37 ℃恒溫箱中水浴解凍15 min，再離心5 min，轉速設定150～200 r/min，離心后去除上清液，若仍有雜質，可使用生理鹽水沖洗后再重復上述步驟，最后使用5 mL注射器抽取懸液約2 mL，直接注射于兔后肢大腿外側肌肉豐富處皮下，2～3周后可觸及質韌腫塊，載瘤模型即可使用。

1.3 建立兔VX2肝癌模型 載瘤兔以水合氯醛（1.0 mL/kg）經耳緣靜脈滴注全麻固定后，目標部位進行消毒鋪巾，逐層將皮膚和皮下的瘤體切開，剝離其后肢外側的瘤體，剪取腫瘤的邊緣呈“魚肉樣”組織若干，置入20 mL生理鹽水試管中，使用眼科剪將瘤塊剪碎成直徑1～2 mm大小。實驗兔用相同的方法全麻，仰臥位固定在操作平面板上，腹部皮膚備皮后消毒鋪巾，行劍突下偏左2 cm的縱行切口，切口處配合利多卡因局麻，逐層切割，鈍性分離腹直肌，暴露肝臟。輕壓上腹兩側或切口下方，即可擠出肝左葉，以18G穿刺針刺入肝左內葉深部約1 cm，用針芯推入制備好的瘤塊3～5個，再以1 mm×10 mm自制明膠海綿條1枚封堵穿刺道，退出穿刺針后先確認無出血后再回納肝臟，最后將切口縫合。術后使用頭孢或青霉素20萬U連續肌注3天以預防感染。

1.4 MRI檢查 所有動物模型建立后均進行MRI多序列掃描（采用美國GE公司的GEDX3.0T超導型磁共振成像系統和人用膝關節線圈）。掃描前應禁食48 h，禁水至少12 h。全麻后使用自制器具仰臥位固定。先是采用SE 序列行T1WI成像（Tr/Te=540 ms/7.1 ms，層間距設定為1.0 mm，層厚設定為4.0 mm，矩陣選擇352×192，視野為14 cm×14 cm，Nex為4，成像持續時間90 s）。再 次 采 用 FSE 序 列 行T2WI成 像（Tr/Te=3180 ms/86.7 ms，層厚和間距參數不變，視野固定為14 cm×14 cm，矩陣選擇320×256，Nex為4，成像持續時間 90s ）。隨后我們采用 EPI序列進行DWI成像（Tr/Te=3000 ms/76.6 ms，b值為0及800 s/mm，FOV 20×15，激發次數8，掃描時間為50 s）。最后行增強掃描，經耳緣靜脈注射釓噴替酸葡甲胺（1 mL/kg）后20 s開始掃描。完整檢查后，每例動物模型均能得到肝臟腫瘤T1WI、T2WI、DWI、ADC和動脈期增強影像資料。

1.5 肝動脈插管及造影術 實驗兔全麻后固定于DSA手術床上。術前首先進行局部無菌手術準備，于右側股動脈搏動處平行表皮紋路切開皮膚，鈍性分離肌肉，輕柔暴露股動脈，下穿縫線緩慢向上提緊近端股動脈主干，暫時阻斷血流。股動脈裸眼觀呈鮮紅色，搏動性強，其內側為股靜脈，血流較動脈暗淡，無搏動性，外側為股神經鞘，內部神經呈灰白色。以小號式頭皮針穿刺股動脈前壁，從穿刺點引入超滑短導絲和4 F血管鞘，再更換扭控導絲并引入4 F-Cobra導管，于腹主動脈右前壁探尋腹腔干開口，行手動造影了解腹腔干及其分支解剖類型，確認腫瘤滋養靶血管后，隨即使用1.8 F或2.6 F微導管裝置，超選擇至肝左動脈或肝固有動脈。微導管高壓注射器造影參數設定為：流速1 mL/s，總量2～3 mL/次，壓力150 PSI，幀數25 fp/s。操作結束后輕柔拔管，并徹底將股動脈破口兩端血管扎閉，消毒縫合后的切口，依據操作時間長短可追加肌注抗生素。

1.6 肝門靜脈插管及造影術 實驗兔全麻后固定于DSA手術床上。術前行無菌準備，沿劍突軟骨下偏右1 cm處縱行切開皮膚，借助動物手術專用拉鉤固定手術視野，輕柔下壓胃體和膨脹的腸管，將尾狀葉向腹腔左上側翻起，隨即暴露肝門部結構，門靜脈主干和下腔靜脈以前后比鄰關系呈現。以小號頭皮針穿刺門靜脈主干前壁，引入自制改良后的血管鞘，亦可用4 F血管鞘，先行手動造影顯示門靜脈一二級分支結構，后引入1.8-2.6 F微導管系統，超選擇至瘤體所在肝左內葉門靜脈二級分支。微導管高壓注射器造影參數設定為：流速2 mL/s，總量3～5 mL/次，壓力300 PSI，幀數25 fp/s。操作后輕柔地拔除導管和血管鞘，立即以棉球輕壓穿刺點，持續30 s以上，確認無出血后可逐層縫合肌肉脂肪組織和皮膚，最后再次消毒。抗生素使用同前。

1.7 觀察指標 肝腫瘤種植后分別于7天、14天、21天隨機挑選20只行MRI檢查，觀察腫瘤信號特征，測量腫瘤直徑和壞死區域直徑，同時觀察肺部轉移瘤發生情況。使用MRI篩選出合適模型，隨機挑選行肝動脈及門靜脈DSA檢查，觀察血管影像解剖和腫瘤造影特征。

1.8 統計學方法 應用SPSS 20.0統計學軟件對其數據進行分析。圖表繪制采用Graphpad Prism6軟件。其中的計量資料以平均數±標準差進行表示，計數資料以計算個數或百分比進行表示。三組數據間用卡方檢驗進行兩兩比較，校驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 兔VX2肝癌模型 70只實驗兔中建模成功69只（建模成功率98.6%），其中1只動物肝內未見腫瘤的生長，僅表現為術后切口及腹腔內種植性轉移，另1只術后切口部分發生了感染，隔離飼養經抗感染治療后痊愈。成功建模動物中基本表現為單發病灶，僅兩只確定為肝內多發病灶。

2.2 MRI影像表現及分析 ①肝臟移植瘤第14天，MRI平掃示VX2肝腫瘤呈較長T1、長T2信號，在T1WI上呈略低信號，T2WI抑脂序列信號不均勻升高，邊界規整清晰。瘤內壞死囊變區呈長T1、長T2信號，其內散在短T1、長T2信號主要為瘤內出血所致，增強掃描瘤體呈明顯環形強化，壞死區及囊變區無強化。DWI顯示腫瘤組織活性部分呈顯著高信號，邊界范圍呈現較平掃時擴大，界線不清晰，無瘤肝臟區域呈無信號或低信號（圖1）。②T2WI抑脂序列中測量肝內腫瘤最大直徑（圖2），術后第7天、14天和21天，腫瘤最大直徑分別為（1.11±0.36）cm、（2.32±0.50）cm和（3.56±0.67）cm，發生肺轉移率同步升高。三個時間點測量的腫瘤直徑兩兩之間差異均存在統計學意義（P＜0.01），隨時間延長腫瘤生長速度加快，肝臟植瘤后第21天，肺轉移發生率較前兩個時間點顯著升高（P＜0.05），見表1。

圖1 MRI影像表現

圖2 肝臟移植瘤后不同時間點肝內腫瘤直徑大小

2.3 DSA造影表現 動脈造影（圖3a）示兔腹腔干主要分支與人類相似，可見肝內腫瘤主要由肝動脈供給，腫瘤滋養血管紊亂扭曲，不規則增粗，動脈期腫瘤活性部分見“染色”現象，瘤內造影劑零星顯影，主要表現為環形造影劑濃聚，此特點與MRI表現一致。門靜脈造影見其二至三級分支清晰顯影，呈倒置樹根狀，腫瘤所在肝葉門靜脈走形基本正常，未見門靜脈參與腫瘤血供（圖3b）。術后第7天、14天和21天，分別行DSA動脈造影，依據腫瘤顯影程度分為富血供和乏血供兩類，隨時間延長富血供腫瘤發生率明顯增加，見表1。

表1 各時間點肺轉移率和富血供腫瘤發生率的比較

圖3 肝臟移植瘤后第14天DSA造影表現

3 討 論

3.1 肝癌動物模型和血管介入操作時間分析 目前肝癌動物模型眾多，常用的肝癌豬模型操作難度大，成本較高；肝癌小鼠和大鼠模型雖操作相對簡便，實驗室配套基礎試劑充分，但血管內操作復雜，不易驗證血管介入技術。兔VX2肝癌模型在血管介入研究中仍是最廣泛應用的動物模型。VX2瘤株實際屬鱗狀細胞癌，由兔乳頭狀瘤經Shope病毒誘發而來。既往研究顯示，該腫瘤生長迅速，種植后約10天，瘤體即可被醫學影像設備成像，此階段腫瘤新生血管豐富，腫瘤細胞快速生長，分布密實，切面呈堅韌“魚肉樣”，中心囊變和壞死較少，植瘤約20天腫瘤進入血管穩定期，瘤體體積迅速增大，因血管生成不能立即滿足新增腫瘤供血，病灶中心出現囊變、壞死。本實驗從MRI多序列成像和DSA造影兩方面相互補充，其影像學特征與同類研究一致，反映了肝臟移植瘤基本生長特點，植瘤7天后腫瘤雖大部分呈實性，但組織內以毛細血管為主，故DSA動脈造影腫瘤多表現為中等血供，不宜行血管介入操作，21天前后腫瘤基本建立自身血供體系，雖動脈造影腫瘤染色顯著，但壞死組織和肺轉移顯著增多，行血管介入偏倚大，故結合既往研究和本實驗，肝臟植瘤后14天左右為血管介入操作時間窗。

3.2 兔VX2肝癌模型建立和血管介入技術操作重點分析 兔VX2肝癌模型建立和血管介入技術已經成熟，經兔股動脈超選擇性腹腔動脈插管技術和腹腔內門靜脈穿刺插管技術應用廣泛。結合本實驗經驗，現將操作重點整理總結如下：①行兔MRI檢查時，全麻下使用泡沫盒固定配合膝關節線圈即可明顯減少運動偽影，有條件的中心可使用小動物專用線圈和呼吸門控技術。②相對于開腹直接分離結扎肝動脈，血管內介入技術用時較長，但后者能更好模擬臨床介入治療過程，且動物本身創傷小，為后續試驗提供便利。③兔肝動脈纖細，直徑2.6F以上的微導管僅能進入肝固有動脈，不宜行超選擇性動脈栓塞，建議使用1.8F微導管，可進入肝左、右動脈一級分支。④兔肝動脈插管技術不斷改進，文獻報道的操作方法趨于固定，但對細節描述上差異較大。本團隊前期實驗中采用直接引入微導管的方法，優點是股動脈損傷小，術后處理方便，缺點是不能預判肝內血管形態進行塑形，延長了超選擇插管的時間；后期實驗中我們改進了插管方法，穿刺股動脈后先引入4F血管鞘和Cobra導管，股動脈充分的彈性完全容下血管鞘和造影導管，血管鞘的保護作用允許反復交換導管，并可防止術中動脈斷裂。另外，造影導管能提供更清晰的血管圖像，同時給予微導管強力的支撐和良好的指向性。⑤暴露門靜脈解剖結構和穿刺置管難度大，劍突下偏右縱切口較為合理。頓性分離腹壁肌肉后，通?？梢姼斡胰~和結腸，按前述方法操作暴露肝門后，門靜脈主干被纖維結締組織鞘包裹，其內伴行膽管，鞘后方深面即為下腔靜脈。穿刺時，應于門靜脈主干偏左斜行入路，避免損傷膽管和下腔靜脈，進針干凈利落，謹防針尖與血管壁產生切割動作，因靜脈壁菲薄缺乏彈性，一旦破裂則無法止血。⑥高壓注射器在MRI和CT成像時可酌情使用，以呈現標準的動脈期圖像，但腹腔內血管纖細，高壓注射時參數設定困難，造影后極易形成假性動脈瘤，幾乎無補救措施，故建議使用手動造影獲取滿足插管條件的圖像。⑦血管變異在兔中亦存在，門靜脈形態較為穩定，肝動脈變異多樣，既往研究有過詳細總結，本中心在實驗中發現部分兔肝固有動脈直接從腸系膜上動脈發出，易于與乏血供腫瘤混淆，必要時應將造影導管置入腸系膜上動脈開口重新造影，以防遺漏。

本研究展現了建立兔VX2肝癌模型和介入操作的基本流程和方法，兔VX2肝移植瘤模型建模成功率高，MRI及DSA均能呈現腫瘤基本特征。雖然兔VX2移植瘤病理類型和血供特點與原發性肝癌存在差異，但其穩定的腫瘤性狀和成熟的介入插管技術，仍能為肝癌的介入治療提供豐富的動物實驗數據，起到重要的臨床指導作用。